CFDA-SE的作用機制及在細胞增殖和體內示蹤中的應用
活細胞標記及其在體內外的長時示蹤成像、細胞增殖檢測是很多課題研究中的重要環節之一，傳統方法在精準度、持續性和多維度分析上存在局限，難以滿足復雜實驗需求。CFDA-SE（CFSE，AbMole，M5117）作為一款熒光素類化合物，具有高效、靈敏、低細胞毒性等優勢，也是細胞示蹤分析、細胞增殖檢測的重要熒光染料。AbMole為全球科研客戶提供高純度、高生物活性的抑制劑、細胞因子、人源單抗、天然產物、熒光染料、多肽、靶點蛋白、化合物庫、抗生素等科研試劑，全球大量文獻專利引用。
一、CFDA-SE（CFSE）的作用機制
CFDA-SE（AbMole，M5117），即5-羧基熒光素二乙酸鹽琥珀酰亞胺酯（CFSE），本身是一種可穿透細胞膜的非熒光性化合物。但當它進入細胞后，胞內的酯酶會將其水解，脫去乙酸鹽基團，進而生成具有高度熒光性的5-羧基熒光素（5-carboxyfluorescein，CF），其激發和發射分別為500nm/520nm。此外，CF分子上的琥珀酰亞胺酯基團能夠與細胞內蛋白質的氨基發生共價結合，使得CF保留在細胞內。在細胞進行分裂時，熒光CF分子會平均分配到子代細胞中，這種特性使其成為細胞標記和增殖檢測的理想探針。
圖 1. CFDA-SE的檢測細胞增殖的原理
二、CFDA-SE的科研應用
1.CFDA-SE（CFSE）用于細胞增殖檢測
一般經過CFDA-SE（CFSE，AbMole，M5117）處理的細胞，可以直接在顯微鏡下觀察（寬場熒光顯微鏡或者激光掃描共聚焦顯微鏡），由于死細胞中酯酶活性丟失，因此只有活細胞會產生CF熒光。此外，可以結合流式細胞術對細胞的增殖分裂情況進行定量分析，CF標記的細胞每分裂一次其子代細胞的熒光會減弱一半，如果細胞沒有分裂則熒光強度最高，如相對熒光強度為50%則表明分裂1次，25%則表明分裂2次，以此類推。實驗人員通過熒光強度對細胞進行分群和量化統計，可以有效地追蹤細胞的分裂次數，從而評估細胞的增殖能力，或者結合細胞分選以獲得具有強分裂能力的細胞用于后續實驗[1]。CFDA-SE也可以結合碘化丙啶（PI，AbMole，M5108）分別進行活細胞和死細胞的染色，這與Calcein-AM/PI活死細胞染色試劑盒（AbMole，M55257）的原理是相同的，可以有效區分活死細胞比例，適用于熒光顯微鏡和流式細胞術等實驗。2014年，AbMole的兩款抑制劑分別被西班牙國家心血管研究中心和美國哥倫比亞大學用于動物體內實驗，相關科研成果發表于頂刊 Nature 和 Nature Medicine。
圖 2. 基于CFDA-SE的PBMC增殖檢測[2]
2.CFDA-SE（CFSE）用于外泌體染色
外泌體是細胞分泌的直徑為30~150 nm的胞外囊泡，可以運送多種生物活性分子（如RNA、脂質和蛋白質），介導細胞間的信息交流。CFDA-SE（CFSE，AbMole，M5117）可以穿過外泌體的膜結構，進入外泌體內部，能用作外泌體在細胞和動物研究中的示蹤劑。例如可以用CFDA-SE標記小鼠肺上皮細胞衍生的外泌體，將外泌體與小鼠骨髓細胞共培養后，發現小鼠骨髓細胞能夠攝取肺上皮細胞外泌體[3]。
圖 3. CFDA-SE標記的外泌體（綠色熒光標記）被小鼠骨髓細胞內吞[3]
3.CFDA-SE（CFSE）用于動物體內的細胞示蹤成像
CFDA-SE（CFSE，AbMole，M5117）同樣可用于動物體內的成像分析，可以先將要標記的細胞在體外和CFDA-SE一同孵育，然后通過靜脈注射或局部注射的方式移植到動物體內。CFDA-SE標記的細胞可以在動物體內監測數周，特別適合長期觀察細胞的動態變化。例如CFDA-SE常用于淋巴細胞的體內示蹤實驗。通過標記小鼠脾細胞并輸注到受體小鼠體內，可以觀察到標記細胞在小鼠外周血、淋巴結和其他組織中的分布。此外CFDA-SE也可用于標記腫瘤細胞，研究腫瘤細胞在體內的遷移和分布。
圖 4. CFDA-SE-labeled T-cells homed specifically to the white pulp of spleen[4]
三、范例詳解
1.Adv Sci (Weinh). 2025 May;12(17):e2409870.
南京醫科大學鼓樓醫院在上述文章中研究了骨肉瘤（Osteosarcoma, OS）細胞衍生的遷移體（Migrasomes, 由遷移細胞產生的囊泡）在骨肉瘤進展中的作用。研究發現OS細胞產生的遷移體（OCDMs）通過促進巨噬細胞的M2極化來加劇骨肉瘤的增殖和轉移。通過進一步探究，實驗人員證實了MFGE8是OCDMs中的關鍵蛋白，通過敲低MFGE8，可以抑制OCDMs的促腫瘤作用。在文章中，AbMole的CFDA-SE（CFSE，AbMole，M5117）被用于標記骨肉瘤細胞，以便研究巨噬細胞對這些細胞的吞噬能力[5]。
圖 5. Flow cytometry analysis of the proportion of BMDMs (APC) that phagocytose apoptotic OS cells (CFDA-SE) and quantitative analysis[5]
2.Cancer Lett. 2023 Aug 1;568:216278.
河北醫科大學在上述論文中開發了一種基于迷你圈DNA（Minicircle DNA, mcDNA）快速生成CD19嵌合抗原受體T細胞（CAR-T細胞）的技術，并評估其在白血病中的抗腫瘤活性和安全性。研究結果表明，使用mcDNA生成的CD19 CAR-T細胞在體外和體內模型中均顯示出與病毒載體生成的CAR-T細胞相當的抗腫瘤效果，并且避免了CAR-腫瘤細胞（CAR-expressing tumor cells）的產生。在實驗中，科研人員使用了由AbMole提供的CFDA-SE（CFSE，AbMole，M5117），用于標記經過mcDNA轉染的CD19 CAR-T細胞，通過流式細胞術檢測細胞數量和CAR表達的變化，評估細胞的增殖能力。上述實驗結果表明，mcDNA-CD19 CAR-T細胞在經過一段時間的培養后，其增殖率逐漸增加，與正常T細胞和病毒載體轉導的T細胞相當[6]。
圖 6. Proliferation curves of normal T, lentivirus CAR-T, and mcDNA-CAR-T cells[6]
參考文獻及鳴謝
[1] Y. M. Tan, J. Hou, X. J. Yang, et al., [Effects of intracellular Porphyromonas gingivalis on proliferation and osteogenic differentiation of human periodontal ligament cells in vitro], Nan fang yi ke da xue xue bao = Journal of Southern Medical University 36(4) (2016) 525-31.
[2] T. S. Dalgaard, L. R. Norup, D. Rubbenstroth, et al., Flow cytometric assessment of antigen-specific proliferation in peripheral chicken T cells by CFSE dilution, Veterinary immunology and immunopathology 138(1-2) (2010) 85-94.
[3] J. M. Aliotta, M. Pereira, E. H. Sears, et al., Lung-derived exosome uptake into and epigenetic modulation of marrow progenitor/stem and differentiated cells, Journal of extracellular vesicles 4 (2015) 26166.
[4] Patiwet Wuttisarnwattana, Saada Eid, David L. Wilson, et al., Assessment of the therapeutic role of mesenchymal stromal cells in a mouse model of graft-versus-host disease using cryo-imaging, Scientific reports 13(1) (2023) 1698.
[5] W. Liu, L. Li, X. Bai, et al., Osteosarcoma Cell-Derived Migrasomes Promote Macrophage M2 Polarization to Aggravate Osteosarcoma Proliferation and Metastasis, Advanced science (Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany) 12(17) (2025) e2409870.
[6] X. Ye, Y. Wu, H. Zhang, et al., Rapid generation of CD19 CAR-T cells by minicircle DNA enables anti-tumor activity and prevents fatal CAR-B leukemia, Cancer letters 568 (2023) 216278.
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