CFDA-SE的作用機(jī)制及在細(xì)胞增殖和體內(nèi)示蹤中的應(yīng)用
活細(xì)胞標(biāo)記及其在體內(nèi)外的長時(shí)示蹤成像、細(xì)胞增殖檢測(cè)是很多課題研究中的重要環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)方法在精準(zhǔn)度、持續(xù)性和多維度分析上存在局限，難以滿足復(fù)雜實(shí)驗(yàn)需求。CFDA-SE（CFSE，AbMole，M5117）作為一款熒光素類化合物，具有高效、靈敏、低細(xì)胞毒性等優(yōu)勢(shì)，也是細(xì)胞示蹤分析、細(xì)胞增殖檢測(cè)的重要熒光染料。AbMole為全球科研客戶提供高純度、高生物活性的抑制劑、細(xì)胞因子、人源單抗、天然產(chǎn)物、熒光染料、多肽、靶點(diǎn)蛋白、化合物庫、抗生素等科研試劑，全球大量文獻(xiàn)專利引用。
一、CFDA-SE（CFSE）的作用機(jī)制
CFDA-SE（AbMole，M5117），即5-羧基熒光素二乙酸鹽琥珀酰亞胺酯（CFSE），本身是一種可穿透細(xì)胞膜的非熒光性化合物。但當(dāng)它進(jìn)入細(xì)胞后，胞內(nèi)的酯酶會(huì)將其水解，脫去乙酸鹽基團(tuán)，進(jìn)而生成具有高度熒光性的5-羧基熒光素（5-carboxyfluorescein，CF），其激發(fā)和發(fā)射分別為500nm/520nm。此外，CF分子上的琥珀酰亞胺酯基團(tuán)能夠與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的氨基發(fā)生共價(jià)結(jié)合，使得CF保留在細(xì)胞內(nèi)。在細(xì)胞進(jìn)行分裂時(shí)，熒光CF分子會(huì)平均分配到子代細(xì)胞中，這種特性使其成為細(xì)胞標(biāo)記和增殖檢測(cè)的理想探針。
圖 1. CFDA-SE的檢測(cè)細(xì)胞增殖的原理
二、CFDA-SE的科研應(yīng)用
1.CFDA-SE（CFSE）用于細(xì)胞增殖檢測(cè)
一般經(jīng)過CFDA-SE（CFSE，AbMole，M5117）處理的細(xì)胞，可以直接在顯微鏡下觀察（寬場(chǎng)熒光顯微鏡或者激光掃描共聚焦顯微鏡），由于死細(xì)胞中酯酶活性丟失，因此只有活細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生CF熒光。此外，可以結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞的增殖分裂情況進(jìn)行定量分析，CF標(biāo)記的細(xì)胞每分裂一次其子代細(xì)胞的熒光會(huì)減弱一半，如果細(xì)胞沒有分裂則熒光強(qiáng)度最高，如相對(duì)熒光強(qiáng)度為50%則表明分裂1次，25%則表明分裂2次，以此類推。實(shí)驗(yàn)人員通過熒光強(qiáng)度對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分群和量化統(tǒng)計(jì)，可以有效地追蹤細(xì)胞的分裂次數(shù)，從而評(píng)估細(xì)胞的增殖能力，或者結(jié)合細(xì)胞分選以獲得具有強(qiáng)分裂能力的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)[1]。CFDA-SE也可以結(jié)合碘化丙啶（PI，AbMole，M5108）分別進(jìn)行活細(xì)胞和死細(xì)胞的染色，這與Calcein-AM/PI活死細(xì)胞染色試劑盒（AbMole，M55257）的原理是相同的，可以有效區(qū)分活死細(xì)胞比例，適用于熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)。2014年，AbMole的兩款抑制劑分別被西班牙國家心血管研究中心和美國哥倫比亞大學(xué)用于動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，相關(guān)科研成果發(fā)表于頂刊 Nature 和 Nature Medicine。
圖 2. 基于CFDA-SE的PBMC增殖檢測(cè)[2]
2.CFDA-SE（CFSE）用于外泌體染色
外泌體是細(xì)胞分泌的直徑為30~150 nm的胞外囊泡，可以運(yùn)送多種生物活性分子（如RNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)），介導(dǎo)細(xì)胞間的信息交流。CFDA-SE（CFSE，AbMole，M5117）可以穿過外泌體的膜結(jié)構(gòu)，進(jìn)入外泌體內(nèi)部，能用作外泌體在細(xì)胞和動(dòng)物研究中的示蹤劑。例如可以用CFDA-SE標(biāo)記小鼠肺上皮細(xì)胞衍生的外泌體，將外泌體與小鼠骨髓細(xì)胞共培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)小鼠骨髓細(xì)胞能夠攝取肺上皮細(xì)胞外泌體[3]。
圖 3. CFDA-SE標(biāo)記的外泌體（綠色熒光標(biāo)記）被小鼠骨髓細(xì)胞內(nèi)吞[3]
3.CFDA-SE（CFSE）用于動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞示蹤成像
CFDA-SE（CFSE，AbMole，M5117）同樣可用于動(dòng)物體內(nèi)的成像分析，可以先將要標(biāo)記的細(xì)胞在體外和CFDA-SE一同孵育，然后通過靜脈注射或局部注射的方式移植到動(dòng)物體內(nèi)。CFDA-SE標(biāo)記的細(xì)胞可以在動(dòng)物體內(nèi)監(jiān)測(cè)數(shù)周，特別適合長期觀察細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化。例如CFDA-SE常用于淋巴細(xì)胞的體內(nèi)示蹤實(shí)驗(yàn)。通過標(biāo)記小鼠脾細(xì)胞并輸注到受體小鼠體內(nèi)，可以觀察到標(biāo)記細(xì)胞在小鼠外周血、淋巴結(jié)和其他組織中的分布。此外CFDA-SE也可用于標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，研究腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的遷移和分布。
圖 4. CFDA-SE-labeled T-cells homed specifically to the white pulp of spleen[4]
三、范例詳解
1.Adv Sci (Weinh). 2025 May;12(17):e2409870.
南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓醫(yī)院在上述文章中研究了骨肉瘤（Osteosarcoma, OS）細(xì)胞衍生的遷移體（Migrasomes, 由遷移細(xì)胞產(chǎn)生的囊泡）在骨肉瘤進(jìn)展中的作用。研究發(fā)現(xiàn)OS細(xì)胞產(chǎn)生的遷移體（OCDMs）通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M2極化來加劇骨肉瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。通過進(jìn)一步探究，實(shí)驗(yàn)人員證實(shí)了MFGE8是OCDMs中的關(guān)鍵蛋白，通過敲低MFGE8，可以抑制OCDMs的促腫瘤作用。在文章中，AbMole的CFDA-SE（CFSE，AbMole，M5117）被用于標(biāo)記骨肉瘤細(xì)胞，以便研究巨噬細(xì)胞對(duì)這些細(xì)胞的吞噬能力[5]。
圖 5. Flow cytometry analysis of the proportion of BMDMs (APC) that phagocytose apoptotic OS cells (CFDA-SE) and quantitative analysis[5]
2.Cancer Lett. 2023 Aug 1;568:216278.
河北醫(yī)科大學(xué)在上述論文中開發(fā)了一種基于迷你圈DNA（Minicircle DNA, mcDNA）快速生成CD19嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T細(xì)胞）的技術(shù)，并評(píng)估其在白血病中的抗腫瘤活性和安全性。研究結(jié)果表明，使用mcDNA生成的CD19 CAR-T細(xì)胞在體外和體內(nèi)模型中均顯示出與病毒載體生成的CAR-T細(xì)胞相當(dāng)?shù)目鼓[瘤效果，并且避免了CAR-腫瘤細(xì)胞（CAR-expressing tumor cells）的產(chǎn)生。在實(shí)驗(yàn)中，科研人員使用了由AbMole提供的CFDA-SE（CFSE，AbMole，M5117），用于標(biāo)記經(jīng)過mcDNA轉(zhuǎn)染的CD19 CAR-T細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量和CAR表達(dá)的變化，評(píng)估細(xì)胞的增殖能力。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，mcDNA-CD19 CAR-T細(xì)胞在經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)后，其增殖率逐漸增加，與正常T細(xì)胞和病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞相當(dāng)[6]。
圖 6. Proliferation curves of normal T, lentivirus CAR-T, and mcDNA-CAR-T cells[6]
參考文獻(xiàn)及鳴謝
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[2] T. S. Dalgaard, L. R. Norup, D. Rubbenstroth, et al., Flow cytometric assessment of antigen-specific proliferation in peripheral chicken T cells by CFSE dilution, Veterinary immunology and immunopathology 138(1-2) (2010) 85-94.
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[4] Patiwet Wuttisarnwattana, Saada Eid, David L. Wilson, et al., Assessment of the therapeutic role of mesenchymal stromal cells in a mouse model of graft-versus-host disease using cryo-imaging, Scientific reports 13(1) (2023) 1698.
[5] W. Liu, L. Li, X. Bai, et al., Osteosarcoma Cell-Derived Migrasomes Promote Macrophage M2 Polarization to Aggravate Osteosarcoma Proliferation and Metastasis, Advanced science (Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany) 12(17) (2025) e2409870.
[6] X. Ye, Y. Wu, H. Zhang, et al., Rapid generation of CD19 CAR-T cells by minicircle DNA enables anti-tumor activity and prevents fatal CAR-B leukemia, Cancer letters 568 (2023) 216278.
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