利拉魯肽的結構如圖 1 所示（賴氨酸 (Lys )側鏈親脂性基團(N-棕櫚酰-γ-谷氨酸)的存在可以延長藥物的半衰期）。
在利拉魯肽固相全合成的實際操作中發現，N 端的第4個或者是第5個氨基酸常存在偶聯不完全的情況。需過量投料，其效率不高，不利于純化。
全保護片段縮合策略是對固相合成的一種補充，但對于片段較長的情況，又存在全保護肽溶 解性差、反應效率低的問題。
 
絲氨酸/蘇氨酸對接法
絲氨酸/蘇氨酸對接法是在常規化學連接策略的基礎上發展起來的一種片段對接方法。
與常規化學連接依賴硫酯和半胱氨酸(Cys)側鏈巰基(-SH)的特異性反應不同；絲氨酸/蘇氨酸對接法主要依靠絲氨酸(Ser)/蘇氨酸(Thr)側鏈羥基與醛基的亞胺捕獲反應實現連接。
該方法的原理是將一個組分的C端轉化為水楊醛酯再與另一組N端絲氨酸/蘇氨酸反應，所得中間體經酸處理；N，O-苯亞甲基乙縮醛部分發生開環，脫去縮醛，變成肽鍵得到目標產物。目前，這一策略主要應用于糖肽、核蛋白及一些環狀肽的制備。
 
利用蘇氨酸對接法實現利拉魯肽片段組氨酸甘氨酸 ( His -Gly) 與片段蘇氨酸-甘氨酸 (Thr -Gly)的連接，合成了利拉魯肽的主鏈。先通N-芴甲氧羰基甘氨酸水楊醛酯(Fmoc-Gly-OSAL) 與蘇氨酸苯甲醇酯(H-Thr-OBzl)的模板反應優化了蘇氨酸對接反應的條件，發現以醋酸/吡啶為溶劑時，底物轉化效率高。
研究了利拉魯肽片段對接的2種路線：
①先片段連接再進行側鏈修飾；
②先修飾再進行片段連接。
研究發現先進行片段對接，再進行側鏈修飾的路線效率更高，室溫下反應4 h底物可完全轉化，中間體經三氟乙酸(TFA)處理，一步完成開環與保護基的脫除，對接收率達 76. 4%。接著對 Lys側鏈(N-棕櫚酰-γ-谷氨酸)的修飾反應進行研究，發現在 pH=10～12的水/乙腈溶液中反應時，能以較高的產率獲得目標修飾產物。
1.
先片段對接，再進行側鏈修飾
將其序列分割為全保護片段叔丁氧羰基-組氨酰(三苯甲基)-丙氨酰-谷氨酰(叔丁基)-甘氨酸［Boc-His(Trt)-Ala-Glu(tBu)-Gly-OH］和脫保護片段Thr-Gly，分別進行合成。將全保護片段4的C端修飾為水楊醛酯，與片段6的N端Thr進行對接。Lys側鏈修飾。
 
全保護肽Boc-His(Trt)-Ala-Glu(tBu)-Gly-OH合成:
以2-氯三苯甲基氯(CTC)樹脂為載體，采用芴甲氧羰基(Fmoc)策略進行固相合成。在 DCM/AcOH體積比為95：5的條件下進行裂解，減壓蒸除溶劑，得到油狀物1。
脫保護肽段Thr-Gly的合成:
以Wang樹脂為載體，采用Fmoc策略進行固相合成，在TFA/TIS/H2O體積比為95∶2.5∶2.5的條件下進行裂解，將反應液加入冰乙醚中沉降，得到白色固體3。
四肽水楊醛酯的合成:
將化合物1溶于DCM中，加入DMAP、DIC、水楊醛和無水硫酸鈉，于30℃下攪拌反應約4h過濾除去固體，濾液減壓蒸干，殘余物經硅膠柱層析純化(乙酸乙酯/石油醚體積比為1∶5～4：1),得白色固體2。
按圖示路線合成化合物4～6。
對接中間體的合成:
將化合物2溶于醋酸/吡啶(摩爾比 3∶1)混合溶液中，加入肽段3，室溫下攪拌反應約4 h。冷凍干燥除去溶劑，得粗產品油狀物4，不經純化，直接用于下一步反應。
線性肽組氨酸甘氨酸(His-Gly)的合成:
將化合物4粗產品溶于TFA/TIS/H2O(體 積比95∶2.5∶2.5)混合溶液中，室溫下反應 40 min；反應液經半制備高效液相色譜(HPLC)純化(乙腈/水)，冷凍干燥得白色粉末5。
利拉魯肽的合成:
Pal-Glu-OtBu與N-羥基琥珀酰亞胺(HOSu)的酯化，得白色固體N-棕櫚酰-谷氨酸(γ-琥珀酰亞胺酯)叔丁酯［Pal-Glu(OSu)-OtBu]，不用純化直接使用。
將化合物5溶于水/乙腈(體積比3∶1)混合溶液中，加入DIEA調節溶液pH10～11。將Pal-Glu(OSu)-OtBu溶于乙腈中，逐滴加入到上述溶液中，滴加完畢，繼續反應30 min。冷凍干燥除去溶劑，殘余物溶于TFA /H2O(體積比95∶5)混合溶液中，室溫下反應 30 min。經半制備 HPLC純化(乙腈/水)，冷凍干燥得白色粉末6，即利拉魯肽。
2.
先修飾后連接合成利拉魯肽
 
利拉魯肽側鏈修飾反應
Lys的側鏈氨基與Pal-Glu(Osu)-OtBu進行偶聯反應得到中間體，中間體經酸處理脫除tBu保護基。由于精氨酸的側鏈胍基(pKa =12.5)有較強的堿性，可控制體系的pH在10～11范圍內，使其質子化，不與OSu酯發生反應; 序列中的其它堿性基團，如N端氨基(pKa=9.5)，其親核性低于 Lys20側鏈氨基(pKa=10.5)，因此偶聯反應會優先發生在 Lys側鏈。
 
Thr-Gly側鏈修飾產物4的合成:
將化合物3溶于水/乙腈(體積比3∶1)混合溶液中，加入 DIEA 調節溶液pH10～11。將 Pal-Glu(OSu)-OtBu溶于乙腈中，逐滴加入到上述溶液中，滴加完畢，繼續反應 30 min。經半制備 HPLC 純化(乙腈/水)，冷凍干燥得白色粉末。
對接中間體5的合成:
將化合物2和四肽水楊醛酯溶于醋酸/吡啶(摩爾比3∶1)混合溶液中，室溫下反應6 h．冷凍干燥除去溶劑，得粗產品油狀物5，不用純化，直接用于下一步反應。
利拉魯肽的合成:
將化合物5粗產品溶于TFA /TIS /H2O(體積比95∶2.5∶2.5)混合溶液中，室溫下反應 30 min;反應液經半制備HPLC純化(乙腈/水)，冷凍干燥得白色粉末產物利拉魯肽。
利拉魯肽(Liraglutide)是一種重要的胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物，于 2010 年被美國食
品藥品監督管理局( FDA) 批準上市，用于治療Ⅱ型糖尿病。
 
《蘇氨酸對接法合成利拉魯肽》