Section.02
鐵死亡檢測(cè)方法

檢測(cè)鐵死亡的方法包括檢測(cè)代謝反應(yīng) (如脂代謝，鐵代謝和 GSH 相關(guān)代謝) 相關(guān)標(biāo)志物含量變化，細(xì)胞形態(tài)變化和分子蛋白含量/活性變化。

1. 過(guò)氧化脂質(zhì)檢測(cè)

脂質(zhì)過(guò)氧化是鐵死亡的核心驅(qū)動(dòng)因素，過(guò)度的脂質(zhì)過(guò)氧化通過(guò)產(chǎn)生有毒的磷脂氫過(guò)氧化物 (PLOOH)，在促進(jìn)鐵死亡中起著重要作用，因此過(guò)氧化脂質(zhì)可用于細(xì)胞鐵死亡的檢測(cè)。

在對(duì)骨關(guān)節(jié)炎中軟骨細(xì)胞鐵死亡的研究中，為了證實(shí) SM@ApoFn nanocage 具有抑制細(xì)胞鐵死亡的功能，作者用脂溶性比率型熒光探針 BODIPY 581/591 C11 來(lái)評(píng)估細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化水平。如圖所示，BODIPY 581/591 C11 (10 μM) 探針?lè)治?IL-1β 預(yù)處理 12 小時(shí)后，各組給予 SM04690、ApoFn 和 SM@ApoFn 處理 24 h 的軟骨細(xì)胞中細(xì)胞膜脂質(zhì)的氧化和還原狀態(tài)，其中 SM@ApoFn 減輕 IL-1β 引起的脂質(zhì)過(guò)氧化。

圖 2. 不同納米藥物處理的 HT-1080 細(xì)胞中的總 ROS 水平檢測(cè)^[2]。 
用 C11-BODIPY 和 DCFH-DA 熒光探針檢測(cè)不同納米藥物處理的 HT-1080 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化和總 ROS。

3. 過(guò)氧化脂質(zhì)衍生物檢測(cè)

脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)過(guò)程中，大量的脂質(zhì)過(guò)氧化初級(jí)產(chǎn)物在氧化反應(yīng)中逐漸分解為一系列復(fù)雜的醛類化合物，包括 MDA，4-HNE，丙醛和己醛等。這些活性醛類物質(zhì)能夠攻擊蛋白質(zhì)等生物大分子，形成加合物，從而引發(fā)細(xì)胞的進(jìn)一步損傷。

在研究真核翻譯起始因子 EIF4E 通過(guò)控制脂質(zhì)過(guò)氧化作為鐵死亡敏感性的決定因素的研究中。科研人員為了研究 4HNE 產(chǎn)量增加是否會(huì)影響反饋回路，從而降低細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性。結(jié)果表明，用 RSL3 處理后，ALDH1B1 的過(guò)表達(dá)限制了 WT 和 EIF4E 過(guò)表達(dá)的 Calu-1 細(xì)胞中 4HNE 的積累，這表明 ALDH1B1 在限制鐵死亡期間細(xì)胞中 4HNE 的產(chǎn)生方面仍然發(fā)揮著重要作用。

需要注意的是，MDA 和 4-HNE 在除鐵死亡外的多種氧化 應(yīng)激狀態(tài)下均可產(chǎn)生，在實(shí)際應(yīng)用中，一般與其他檢測(cè)方法進(jìn)行相互驗(yàn)證，以提高結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。

圖 3. 用 RSL3（0.5 μM，4 小時(shí)）處理不同過(guò)表達(dá)體系的 Calu-1 細(xì)胞中 4HNE 染色的免疫熒光分析^[3]。

4. 鐵代謝相關(guān)生物標(biāo)志物檢測(cè)

鐵死亡過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)亞鐵離子的積累會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激的增加，促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化。因此，細(xì)胞鐵含量或者 Fe²⁺/Fe³⁺ 比值的測(cè)定可作為鐵死亡監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)。FerroOrange 是一種特異性 Fe²⁺ 探針，與 Fe²⁺ 結(jié)合形成橙色熒光復(fù)合物，可通過(guò)熒光顯微鏡或流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) (Ex/Em: 542/572 nm), 從而定量分析細(xì)胞內(nèi) Fe²⁺ 的濃度。

研究人員在明確 PGS（一種天然產(chǎn)物 P-L）對(duì)腎臟、智力及神經(jīng)保護(hù)的潛在作用，探索 PGS 的確切靶點(diǎn)及作用機(jī)制。在研究 PGS 是否減輕缺氧 BV2 細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化物積累引起的鐵死亡實(shí)驗(yàn)中，使用 FerroOrange 染色，PGS 可減輕 BV2 細(xì)胞中缺氧 (HH) 誘導(dǎo)的鐵死亡。

圖 4. PGS (一種天然產(chǎn)物 P-L, 50 μg/mL; P-M, 100 μg/mL; P-H, 200 μg/mL) 可減輕 BV2 細(xì)胞中缺氧 (HH) 誘導(dǎo)的鐵死亡^[4]。

5. 谷胱甘肽代謝相關(guān)生物標(biāo)志物檢測(cè)

谷胱甘肽 (GSH) 是細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化劑，在鐵死亡過(guò)程中，GSH 水平顯著下降，導(dǎo)致抗氧化能力減弱， 進(jìn)而促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化物的積累。因此，檢測(cè) GSH 相關(guān)代謝等指標(biāo)可用于監(jiān)測(cè)鐵死亡的過(guò)程。

鐵死亡在腸缺血再灌注損傷中起著至關(guān)重要的作用，抑制鐵死亡可能為治療該疾病提供新的途徑，研究人員在對(duì)鐵死亡發(fā)生的小鼠腸道缺血再灌注模型中進(jìn)行檢測(cè)，再灌注 30 min 后，組織中總鐵和 Fe²⁺ 含量最高，LPO 產(chǎn)物 MDA 也隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)而積累，還原型 GSH 水平降低，氧化型 GSSG 水平升高。

圖 5. 小鼠腸道缺血再灌注模型中，再灌注 30 min 后使用 GSH + GSSG/GSH 檢測(cè)試劑盒評(píng)估腸道組織中谷胱甘肽、GSH、GSSG 和 GSH/GSSG 水平^[5]。

6. 細(xì)胞和亞細(xì)胞水平的形態(tài)學(xué)檢測(cè)

鐵死亡細(xì)胞的典型形態(tài)學(xué)特征包括質(zhì)膜完整性喪失，細(xì)胞膜破裂，線粒體萎縮，線粒體外膜破裂、嵴減少或缺失、膜密度增加，可通過(guò)透射電子顯微鏡 (TEM) 檢測(cè)。此外，鐵死亡發(fā)生時(shí)，也伴隨著線粒體膜通透性增加和線粒體膜電位降低，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)粘度增加和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激， 以及溶酶體鐵或一氧化氮 (NO) 的累積。可借助相關(guān)熒光探針，用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測(cè)。

在研究溴結(jié)構(gòu)域蛋白 4（BRD4）抑制 Erastin 誘導(dǎo)的鐵死亡中，研究人員使測(cè)量了 BRD4 抑制前后細(xì)胞的氧化分解代謝，與 Erastin 處理組相比，當(dāng) BRD4 被其抑制劑 (+)-JQ1 和 PFI-1 抑制時(shí)，檢測(cè)到的線粒體膜電位低得多。

圖 6. Erastin (10 μM, 24 h) 誘導(dǎo) HT1080 鐵死亡，JC-1 檢測(cè)線粒體膜電位變化^[6]。 

7. 調(diào)控鐵死亡的基因和蛋白的檢測(cè)

鐵死亡主要由鐵依賴性脂質(zhì)過(guò)氧化引起，其調(diào)控機(jī)制包括多種，主要分為過(guò)氧化代謝部分 (如鐵代謝和脂代謝途徑) 和抗氧化部分 (如 System xc^--GSH-GPX4 途徑，AIFM2-CoQ10/GCH1-BH4/ ESCRT-III 和 DHODH 途徑)。鐵死亡發(fā)生時(shí)，一些關(guān)鍵基因和蛋白表達(dá)水平發(fā)生變化，因此，采用 Western blot / 免疫熒光 / 免疫組織化學(xué) / 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)等方法來(lái)表征鐵死亡的發(fā)生。

在探討鐵死亡是否參與缺氧缺血性腦損傷及其機(jī)制的研究中，通過(guò)阻斷左頸總動(dòng)脈建立 7 日齡雄性 Sprague-Dawley 新生大鼠 HIBD 模型。HIBD 組大鼠的活性氧水平顯著升高，鐵代謝相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白受體 (TFRC)、鐵蛋白重鏈 (FHC)、鐵蛋白輕鏈 (FLC) 的蛋白水平顯著升高，而 SLC7A11、GSH、GPX4 的蛋白水平降低，這些變化導(dǎo)致細(xì)胞抗氧化能力下降、線粒體損傷，引起大腦皮層神經(jīng)元鐵死亡。

圖 7. 通過(guò)阻斷左頸總動(dòng)脈建立 7 日齡雄性 Sprague-Dawley 新生大鼠 HIBD 模型后 72 小時(shí)腦組織中鐵死亡相關(guān)蛋白的水平^[7]。 

Section.03
小結(jié)

今天，小 M 給大家詳細(xì)介紹了鐵死亡的關(guān)鍵指標(biāo)和對(duì)應(yīng)的檢測(cè)方式，檢測(cè)指標(biāo)也呈現(xiàn)出多樣化的特點(diǎn)。鐵死亡收到多條通路的調(diào)控，在實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)程中，各個(gè)通路相輔相成，互相影響，大家在檢測(cè)鐵死亡時(shí)，需要組合出擊，多種檢測(cè)方式共同驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果才會(huì)更有說(shuō)服力哦。

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