貼壁細(xì)胞培養(yǎng)攻略
 

一，貼壁細(xì)胞的分類及形態(tài)

貼壁細(xì)胞一般分為皮細(xì)胞型，成纖維細(xì)胞型，游走細(xì)胞型和多型細(xì)胞型。

在顯微鏡下觀察時(shí)，貼壁細(xì)胞在瓶底伸展并延伸成梭型或不規(guī)則的三角形或扇形或其它形態(tài)，而且晃動(dòng)培養(yǎng)液時(shí)，細(xì)胞不動(dòng)。培養(yǎng)細(xì)胞在未貼附于底物之前一般均似球體樣；當(dāng)與底物貼附后，細(xì)胞將逐漸伸展而形成一定的形態(tài)，呈成纖維細(xì)胞樣或上皮細(xì)胞樣等。

二，實(shí)驗(yàn)材料與儀器

實(shí)驗(yàn)材料：細(xì)胞、PBS 或 DPBS、0.25% (w/v) Trypsin-EDTA、75% 乙醇、培養(yǎng)基、100X 雙抗（鏈霉素-青霉素）、胎牛血清、細(xì)胞凍存液。

實(shí)驗(yàn)儀器及耗材：培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶、移液槍、離心管、記號(hào)筆、封口膜、凍存管、程序降溫凍存盒、液氮罐、離心機(jī)、37℃ 恒溫培養(yǎng)箱（5% 二氧化碳濃度）、倒置相差顯微鏡、冰箱、無菌細(xì)胞操作臺(tái)。

三，實(shí)驗(yàn)步驟

1. 試劑準(zhǔn)備

DMEM完全培養(yǎng)基（10% 胎牛血清）：44.5 mL DMEM +5 mL 胎牛血清+500 μL 100X 雙抗，搖勻，4 ℃ 冷藏保存，使用前于 37 ℃ 恒溫水浴鍋中預(yù)熱 15 分鐘。

PBS、完全培養(yǎng)基、根據(jù)細(xì)胞特性選擇合適的解離液或機(jī)械吹打消化細(xì)胞、胰蛋白酶解離劑 0.25% (w/v) Trypsin-EDTA于 4℃ 冷藏保存，使用前于 37 ℃ 恒溫水浴中鍋預(yù)熱 15 分鐘。

2. 細(xì)胞復(fù)蘇

1) 超凈工作臺(tái)使用前紫外線照射 30 分鐘。使用前，后用 75% 酒精擦拭臺(tái)面。保持臺(tái)面干凈整潔。使用時(shí)一定打開通風(fēng)。

2) 將凍存細(xì)胞從 -80 度冰箱或液氮罐中取出，立即放入（2 分鐘內(nèi)）37 ℃ 恒溫水浴中預(yù)熱水浴鍋中（或在手心中反復(fù)摩擦），不停晃動(dòng)以化凍。

3) 立刻將化凍的細(xì)胞液轉(zhuǎn)移進(jìn)裝有 3 mL DMEM完全培養(yǎng)基的 5 mL離心管中并吸打均勻。注意液體不要留在瓶口或瓶蓋上，避免增加污染的可能。

4) 復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)，離心機(jī)提前降溫至 4℃，以 1000 rpm 的轉(zhuǎn)速將細(xì)胞懸液離心 5 分鐘并棄上清。

5) 用 3 mL DMEM 完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移進(jìn) 6 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

6) 在顯微鏡下觀察復(fù)蘇細(xì)胞的狀態(tài)，并及時(shí)更換DMEM完全培養(yǎng)基。

7) 當(dāng)細(xì)胞密度占顯微鏡視野 80%～90% 時(shí)，應(yīng)進(jìn)行細(xì)胞傳代。

3. 貼壁細(xì)胞傳代（以 6 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿為例）

1) 棄置原培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，從培養(yǎng)皿邊緣加入 2 mL 預(yù)熱的 PBS 平衡鹽溶液潤洗細(xì)胞（注意不要直接沖到細(xì)胞表面）。

2) 沿培養(yǎng)基側(cè)壁加入1 mL 預(yù)熱的 0.25% (w/v) Trypsin-EDTA，使胰蛋白酶完全覆蓋細(xì)胞表面。于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，孵育時(shí)間根據(jù)細(xì)胞的特點(diǎn)而定。

3) 向培養(yǎng)皿中加入1 mL 完全培養(yǎng)基中和 Trypsin 的作用，并輕輕吸打細(xì)胞表層數(shù)次。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到 5 mL 離心管中，在室溫下以 1000 rpm 的轉(zhuǎn)速將細(xì)胞懸液離心 3 分鐘。

4) 小心棄去離心管中的上清液，使用 1mL 完全培養(yǎng)基輕輕重懸細(xì)胞沉淀，使其完全被吹打?yàn)閱蝹�(gè)細(xì)胞狀態(tài)，盡量減少泡沫的產(chǎn)生。

5) 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后以 1:3（1:3～1:6均可）的比例進(jìn)行細(xì)胞傳代。

6) 取三只新 6 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿，每只培養(yǎng)皿中加入 3 mL 完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞懸液平均分配至三只培養(yǎng)皿中，蓋上蓋子后，按照畫十字的操作，將細(xì)胞搖勻。

7) 細(xì)胞培養(yǎng)皿放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞狀態(tài)并及時(shí)更換培養(yǎng)液。
 

逐典TrypLUS消化液是一種胰蛋白酶類似物（Trypsin Like Enzyme），是一種通過生物工程制備的非動(dòng)物源性重組蛋白酶，與胰蛋白酶有相似的解離動(dòng)力學(xué)，穩(wěn)定性更高，純度更好，消化更溫和，細(xì)胞毒性更低。目前主要應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)中，可以在賴氨酸和精氨酸的C末端切割肽鍵，可以替代豬或牛胰蛋白酶（Trypsin）對(duì)貼壁細(xì)胞的消化解離。生物制藥中，GMP級(jí)別的TrypLUS能夠?yàn)橐呙缟�產(chǎn)、病毒載體生產(chǎn)提供高質(zhì)量和高性價(jià)比的貼壁細(xì)胞消化解決方案。