非泛素化Midnolin蛋白酶體降解途徑助力藥物開發
泛素化，顧名思義，肯定需要泛素的參與。泛素-蛋白酶體系統 (UPS)，則同時與泛素和蛋白酶體有關。
真核細胞中的兩種主要降解系統：泛素-蛋白酶體系統和溶酶體降解系統。在真核細胞內，80% 以上的蛋白質的降解都依賴于“泛素-蛋白酶體系統”。
這一降解過程可以分為兩個階段：(1) 給廢棄蛋白質“貼標簽”: 泛素與底物蛋白的相互作用，底物帶上泛素標簽；(2) “標簽”蛋白質進行“廢物處理”: 經過泛素化修飾的蛋白質被特定的蛋白酶體識別，從而被降解[1]。
圖 1. 泛素介導的蛋白質降解過程[1]。
首先，泛素與 E1 (泛素激活酶) 共價結合，然后被轉移至 E2 (泛素結合酶) 上。接著，E3 (泛素-蛋白質連接酶) 將泛素從 E2 轉移到底物蛋白上，并在 E4 酶 (鏈延長因子) 的催化下延長鏈長，最終使底物蛋白帶上了泛素標簽。相關調節顆粒可以識別連接在蛋白質上的多泛素鏈標簽，并啟動降解過程[1]。
蛋白酶體除了通過上述經典的“泛素-蛋白酶體系統”降解蛋白以外，還可以通過非泛素化修飾降解蛋白。例如，已有研究表明，Fos 家族可通過泛素化依賴的和不依賴的兩種機制被降解[2]。但一直以來，關于 IEG 蛋白 (Immediate-early genes) 迅速靶向降解的機制，尚不清楚，直到……
近日，來自哈佛醫學院的 Michael E. Greenberg 教授團隊在頂尖期刊 Science 上發布了一項突破性的研究成果。
Michael E. Greenberg 團隊通過全基因組 CRISPR-Cas9 篩選調控 IEGs 蛋白穩定性的基因，發現了一種哺乳動物中基本未被表征過的 Midnolin 蛋白，其可以促進不同 IEGs 蛋白的蛋白酶體降解。進而發現了一種全新的蛋白降解機制——Midnolin-蛋白酶體途徑。
圖 2. Midnolin-蛋白酶體途徑降解核蛋白過程[1]。
Midnolin 受多種因素誘導，包括生長因子和神經元刺激。在細胞核內，Midnolin 通過 C 端 α 螺旋 (αHelix-C) 與蛋白酶體結合，利用 Catch 結構域實現選擇性，并通過 N 端泛素樣結構域 (Ubl) 促進結合底物的降解 (圖 2)。研究發現，Midnolin-蛋白酶體途徑繞過典型的泛素化系統來實現許多核蛋白的選擇性降解[2]。
早期研究：Midnolin 最初由 T sukahara 等人在胚胎干細胞中發現 (2000 年)[4]。
(1) 利用基因捕獲方法 (Gene trap) 和體外胚胎干細胞的選擇，確定了參與核仁神經發生相關基因調控的新基因--Midnolin。
(2) Midnolin 編碼一種含有 508 個氨基酸 (aa) 的蛋白質，其中包含一個泛素樣結構域。
(3) 利用 Midnolin-綠色熒光蛋白 (GFP) 融合蛋白研究 Midnolin 在細胞內的分布 。Midnolin 被發現定位于細胞核和核仁，但不在細胞質中。核仁定位信號 (NLS) 為位于 Midnolin C 端區域的包含 28 個氨基酸的肽 (440-QQKRLRRKARRDARGPYHWTPSRKAGRS-467)。
▐ Midnolin 是 IEG 蛋白質降解的調節劑
為了研究 IEGs 蛋白質降解的機制，作者重點研究了兩種常見的來自不同蛋白家族的轉錄因子——EGR1 和 Fos。通過構建穩定表達 EGR1 或 FosB GPS (The global protein stability) 報告基因的 HEK-293T 細胞系，并進行了全基因組 CRISPR-Cas9 篩選，發現 MIDN 是負調節 EGR1 和 FosB 穩定性的熱點基因。并發現敲除 MIDN 基因會增加 EGR1 和 FosB 穩定性。
圖 3. Midnolin 是 IEGs 蛋白降解的調節劑，可促進多種 IEG 蛋白的降解[2]。
A-C：遺傳學篩選顯示 Midnolin 是 IEGs 蛋白降解的調節。(A) 構建穩定表達 EGR1 或 FosB GPS 報告基因的 HEK-293T 細胞系并進行全基因組 CRISPR-Cas9 篩選示意圖。(B-C) 遺傳篩選結果，顯示 MIDN 是負調節 EGR1 和 FosB 穩定性的熱點基因。D-G：Midnolin促進生理環境中多種 IEG 蛋白的降解。(D-E) NIH/3T3 細胞中敲除/過表達 Midnolin 對 EGR1、FosB、c-Fos 和 NR4A1 蛋白水平的影響; (F-G) 初級皮層神經元中敲除/過表達 Midnolin 對 EGR1、FosB、c-Fos 和 NR4A1 蛋白水平的影響。
此外，在 NIH/3T3 成纖維細胞 (圖 3D-E) 和初級皮層神經元 (圖 3F-G) 中過表達 Midnolin 降低了多種 IGEs 蛋白水平，如 EGR1、FosB、c-Fos 和 NR4A1，且敲除 Midnolin 結果與之相反。上述結果表明這些 IEGs 蛋白可能都通過 Midnolin 發生靶向降解。進一步研究顯示，Midnolin 可能還參與了細胞核內除 Fos 和 EGR1 外數百種其他轉錄因子的降解。
作者將內源性 Midnolin 用 3xHA 標記，進行質譜分析發現 Midnolin 可免疫共沉淀 19 S 調節顆粒和 20 S 核心顆粒體 (圖 4A)。同時，使用 MG132 (蛋白酶體抑制劑) 抑制底物蛋白的降解，發現 Midnolin 與底物 c-Fos、FosB、EGR1 存在相互作用，且與 PSMD2 和 PSMA2 (分別為 19 S 和 20 S 蛋白酶體的組成部分) 存在相互作用 (圖 4B)。
(A) 將 3xHA 標簽引入 HEK-293T 細胞中內源性 Midnolin 的 N 末端。細胞用 MG132 處理 6 小時后進行 3xHA-Midnolin 免疫沉淀，并進行質譜分析。(B) Midnolin 免疫共沉淀蛋白酶體和 內源 IEGs 蛋白。PMA: PKC 激動劑，誘導 IEGs 的轉錄。(C) 內源性 Midnolin 水平因抑制蛋白酶體而顯著增加，但不會因抑制泛素 E1 而增加。
此外，MG132 可增加 Midnolin 蛋白水平，但 TAK-243 (泛素 E1 酶抑制劑) 則不影響 Midnolin 蛋白水平 (圖 4C)，且 TAK-243 并不影響 Midnolin 對底物蛋白的降解，由此證明 Midnolin 降解蛋白不依賴于泛素化。
注：26S 蛋白酶體由中間一個圓柱形 20S 核心顆粒和兩端覆蓋的一個或兩個 19S 調節顆粒組成。
▐ Midnolin 含三個協同作用的結構域，促進結合底物的蛋白酶體降解
作者通過使用人工智能平臺 AlphaFold 進行結構預測，顯示 Midnolin 蛋白包含三個穩定的結構域: 位于 N 末端的泛素樣結構域 (Ubl)、含兩部分假對稱 (pseudosymmetric) 的“捕獲 Catch”結構域、和一個位于 C 末端的長 α 螺旋 (α Helix-C) (圖 5A)。
接下來，作者使用免疫共沉淀實驗以確定 Midnolin 與底物和/或蛋白酶體相互作用所需的結構域。結果顯示，Ubl 結構域的點突變/缺失/誘變對 Midnolin 與EGR1 或蛋白酶體的相互作用無影響，但 Catch 結構域的缺失使得底物蛋白 (如 EGR1) 無法被沉淀下來 (圖 5C 左)，α Helix-C 或 NLS 結構域的缺失使得蛋白酶體 (如 PSMD2) 無法被捕獲 (圖 5C 右)。
圖 5. Midnolin 包含三個結構域，它們協同作用以促進底物的蛋白酶體降解[2]。
(A) AlphaFold 預測的 Midnolin 結構; (B) 引入 Midnolin cDNA 的突變或截短的示意圖; (C) 使用 CMV 啟動子對 HEK-293T 細胞穩定表達 2XFlag Midnolin，用 10 μM MG132 處理細胞 6 小時，并進行免疫印跡。
也就是說，Midnolin 通過 Catch 結構域與目標蛋白相互作用，通過 α Helix-C 結構域與 26S 蛋白酶體結合。同時，Midnolin 可通過其 Catch 結構域結合底物內的非結構化區域 (unstructured regions)，并形成 β 鏈。雖然 Midnolin-蛋白酶體途徑可繞過泛素化系統來實現許多核蛋白的選擇性降解，但關于如何實現特異性的靶蛋白降解還有待深入研究。
本期小 M 帶大家回顧了經典的泛素化蛋白質降解過程，并介紹了一種全新蛋白降解機制 —— Midnolin-蛋白酶體途徑，該途徑可繞過泛素化系統來實現許多核蛋白的選擇性降解。小 M 相信，基于 Midnolin 的新型靶向蛋白降解類藥物將會被逐漸開發出來，用于神經或精神疾病，癌癥等疾病的研究~
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蛋白酶體抑制劑 (IC50: 100 nM)，可誘導凋亡和自噬。 |
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泛素 E1 酶 (UBA1) 抑制劑，抑制蛋白泛素化。 |
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PKC 和 SphK 激活劑，可誘導 IEGs 的轉錄。 |
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200+ 活性化合物，用于泛素化及相關疾病研究。 |
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參考文獻：
[1] Tai HC, et al. Ubiquitin, the proteasome and protein degradation in neuronal function and dysfunction. Nat Rev Neurosci. 2008 Nov;9(11):826-38.
[2] Gu X, et al. The midnolin-proteasome pathway catches proteins for ubiquitination-independent degradation. Science. 2023 Aug 25;381(6660):eadh5021.
[3] Obara Y, et al. Midnolin is a novel regulator of parkin expression and is associated with Parkinson's Disease. Sci Rep. 2017 Jul 19;7(1):5885.
[4] Tsukahara M, et al. Novel nucleolar protein, midnolin, is expressed in the mesencephalon during mouse development. Gene. 2000 Aug 22;254(1-2):45-55.
