細胞器脂滴的生物發生和在檢測中的相關應用
脂滴的結構
脂滴 (Lipid droplets, LDs) 是一種呈球狀的細胞器，也稱為脂質體或油體。與其他細胞器不同，脂滴的表面是單層的磷脂膜，在哺乳動物細胞中，脂滴單分子膜的主要成分是磷脂酰膽堿 (Phosphatidylcholine, PC)，高達60%，其次是磷脂酰、磷脂酰肌醇等[1] 。在磷脂膜上有超過 200 種不同的結構蛋白和功能蛋白定位于 LDs 的表面，如 DGAT2、Rab18、脂滴包被蛋白 (Perilipin) 和 CCT 等，調節 LD 內穩態和細胞內相互作用[2,3] 。脂滴的核心是中性脂質，如三酰甘油酯 (Triacylglycerols, TAG) 和甾醇酯 (Sterol esters, SE) 等，沉積在脂滴中，在白色脂肪細胞中，TAG 主要以脂類酯的形式儲存在脂滴中，而在類固醇細胞中，SE 是主要成分，此外，根據細胞類型的不同，許多其他內源性中性脂質如視黃醇酯、醚脂質和游離膽固醇也儲存在脂滴核內[4] 。
圖 1. 脂滴的結構特征[4]
脂滴的生物發生
由于脂滴特殊的親水/疏水兩性結構，科學家對其的產生一直在不斷的進行中，目前廣泛認為，在原核生物中，中性脂質的積累是在質膜的特定脂質結構域開始的，最后形成了細胞質脂滴。在真核生物中，脂滴發生于內質網中的磷脂雙分子層的小葉內，內質網雙分子層之間累積的中性脂的體積增加超過了溶解度的極限，脂滴即從內質網雙分子層中被油化出來[5,6] 。
圖 2. 原核生物和真核生物中脂體形成的模型[6]
在原核生物中，中性脂質體的形成始于 WS/DGAT 附著在細胞質膜上，隨后合成小脂滴，形成被單層 PLs 包裹的產油層。脂質體前體由 SLD 聚集和融合形成，形成膜結合的脂質體前體，然后形成細胞質脂質體。真核生物的油體是由內質網膜的兩個小葉之間的脂質漸進式積累形成的，并可能有結構蛋白的共翻譯插入，從而形成出芽的油體并釋放到細胞質中。
脂滴的功能
許多生物在細胞中儲存脂質以產生代謝能量，以防能量來源不足。但脂滴不是簡單的脂質儲存庫，而是具有多種細胞功能的復雜細胞器[7] 。除了在能量代謝中發揮作用外，脂滴也是細胞內和細胞間脂肪酸運輸的重要節點，還在各種細胞事件中發揮作用，如蛋白質降解、隔離轉錄因子和染色質成分以及為某些核受體生成脂質配體[8] 。此外，病毒核衣殼蛋白核心本身可與脂滴表面結合并協調病毒感染的持續傳播[9] 。脂滴相關檢測
由于脂滴功能的多樣性，其異常與許多病理狀態相[10] 。因此，了解脂滴的生物學特性和功能便尤為重要。下面小 M 就來為大家介紹一下脂滴常用的染料檢測。■ 油紅 O (Oil Red O) 染色
脂質代謝改變和腎臟內的過度脂質沉積被認為是腎臟疾病進展的重要有害因素，據報道，自噬可通過誘導脂質分解和促進脂滴形成的雙向機制參與脂代謝調控。
Beclin-1 是自噬體的標記物，為驗證 Beclin-1 與纖維化腎小管上皮細胞 (Tubular epithelial cells, TECs) 自噬誘導的脂質積累是否有關，通過 Oil Red O 染色觀察在TGF-β1(可引起自噬激活和脂質積累) 刺激下，Beclin-1 敲低的 HK-2 細胞中脂質沉積。結果顯示，TGF-β1 刺激下，Ctrl siRNA 轉染的 HK-2 細胞的脂質水平升高，但在 Beclin-1 敲除的 HK-2 細胞中脂質水平不顯著 (圖 3)。以上表明，Beclin-1 參與了自噬誘導的 LDs 在腎纖維化的 TECs 中的積累。
圖 3. 油紅 O 染色細胞的圖像處理[11]
油紅O (Oil Red O) 染色是一種簡單的定性方法，當油紅 O 與脂滴接觸時,會直接進入細胞/組織內脂質中，使其染為紅色。
步驟(參考)：1. 將腎組織或細胞玻片的冰凍切片在 PBS 中洗滌，多聚甲醛固定 30 min。2. 樣品在 60% 異丙醇中孵育 3 min，然后用新鮮制備的 60% 油紅 O 染色 30 min, 60% 異丙醇染色 1 min，用 PBS 洗滌。3. 樣本用蘇復染。切片使用顯微鏡進行可視化。4. 使用 Image J 軟件按照標準程序對脂滴數量和大小進行定量。
■ 尼羅紅(Nile Red) 染色
除油紅 O 染色以外，Nile Red 也是一種常用的熒光探針，能夠定位及定量細胞內的脂質。如，在研究未羧化骨鈣素 (Uncarboxylated osteocalcin, GluOC) 對肝細胞作用的機制時，以油酸/棕櫚酸 (Oleic acid/Palmitic acid, OA/PA) 誘導的細胞作為非酒精性脂肪性肝病細胞模型，通過 Nile Red 染色檢測三酰甘油水平。結果顯示，GluOC 降低了甘油三酯水平。表明 GluOC 抑制了 OA/PA 誘導的 NCTC 1469 細胞中的脂質積累。
圖 4. Nile Red 染色染色來監測 GluOC 處理后的細胞內脂滴[12]Nile Red 又叫尼羅紅，是一種親脂性的惡嗪類熒光探針，在水中和其他極性溶液中不發熒光，在非極性溶劑中出現明亮的紅色熒光，能夠定位及定量細胞內的脂質。
步驟 (參考)：1. PBS 洗滌樣本 3 次， 4% 多聚甲醛固定 15 min，然后用 0.5% Triton X-100 處理 15 min。2. 用 Nile Red 工作液在室溫下染色 60 分鐘。3. 染色結束，去除多余的染料，用 PBS 洗滌細胞 3 次。4. 使用光學顯微鏡拍攝照片。
■ BODIPY 脂滴類染料
此外，BODIPY 類染料也是脂滴標記的染料，最大特點是其非對稱性，可以很好的連接標記基團 (比如親脂類結構)，穿過細胞膜進入細胞內部，通過在細胞內的極性脂類上定位以進行特異性染色。BODIPY 類染料可用于標記活細胞和固定細胞，還可用于光動力學療法的研究。
如，研究設計成熟的脂肪細胞 (Apo) 包裹棕櫚酸結合的雷公藤甲素衍生物 (pTP) 和光敏劑 Ce6 (pTP-Ce6-Apo)，用于黑色素瘤的光動力學治療。為探討 pTP-Ce6-Apo 能否將脂肪細胞內的脂滴轉運到 A375 細胞內，以及 pTP-Ce6-Apo 能否釋放 Ce6 并被 A375 細胞攝取，使用 BODIPY 505/515 染色 pTP-Ce6-Apo。結果顯示 A375 細胞周圍分布著少量的脂滴，表明 A375 細胞可以從脂肪細胞中攝取脂滴并為自己所用。同時，A375 細胞核周圍有少量紅色熒光為 Ce6，表明 Ce6 從 pTP-Ce6-Apo 中成功釋放并被 A375 細胞攝取。
圖 5. pTP-Ce6-Apo的脂滴和Ce6與A375細胞核共定位[13]
BODIPY，也叫硼，BDP，是以硼二 (boron-dipyrromethene) 為熒光結構母核的染料。其對環境的極性和 pH 值相對不敏感，因此，在不同生理條件下相對穩定。
步驟 (參考)：1. 將 BODIPY 標記的 pTP-Ce6-Apo 置于 Transwel l小室上層，A375 細胞玻片置于底層。共培養后，取出 A375 細胞片。2. 用多聚甲醛固定，避光后染色。3. 在激光共聚焦顯微鏡下觀察制備的 A375 細胞片。
下面是小 M 為大家整的一些 Bodipy 類相關染料，方便大家更好地進行脂質代謝相關研究~
表 1. Bodipy 類相關脂滴染料
| Product Name | Ex/Em (nm) |
| BODIPY 493/503 methyl bromide | 493/503 |
| BODIPY 493/503 | 493/503 |
| BODIPY 505/515 | 505/515 |
| BODIPY 500/510 C1, C12 | 500/510 |
| BODIPY FL C12 | 480/508 |
| BODIPY 558/568 C12 | 558/568 |
| 相關產品 |
| Nile Red 尼羅紅 (Nile Red) 是一種親脂染色。它具有環境敏感性熒光。尼羅紅在富脂環境中熒光強烈，而在水介質中熒光微弱。它是熒光顯微鏡和流式細胞熒光法檢測細胞內脂滴的極好的重要染色劑。尼羅紅將細胞內脂滴染成紅色。熒光波長 559/635 nm。 |
| BETA-1 BETA-1 是第一個分子內電荷轉移聚集誘導發射集成分子 (TICT-AIE integration molecule)。BETA-1 在脂滴 (LD) 中發出青色熒光，在線粒體中發出紅色熒光。BETA-1 可用于脂滴和線粒體在體內和體外的同時和雙色成像。 |
| Oil Red O Oil Red O 是一種脂溶性重氮染料，最大吸收波長為 518 nm。Oil Red O 染色中性脂和膽固醇酯，但不染色生物膜。Oil Red O 在小鼠肝活檢中可用于檢測和定量肝脂肪變性。Oil Red O 染色可以有效地觀察代謝疾病發生和進展時組織發生的根本變化。 |
| LipidGreen 2 LipidGreen 2 是用于脂質成像的第二代小分子探針。與之前的 LipidGreen 相比，LipidGreen 2 具有更好的熒光信號，可以選擇性地染色細胞中的中性脂質和活斑馬魚的脂肪沉積物。 |
參考文獻
[1] Schaffer, J. E. Lipotoxicity: when tissues overeat. Curr. Opin. Lipidol. 14, 281–287 (2003).
[2] Fawcett, D. W. An Atlas of Fine Structure: The Cell, Its Organelles, and Inclusions (Saunders, 1966).
[3] Farese RV Jr, et al. Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 2009 Nov 25;139(5):855-60.
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[12] Wang, D.; Zhang, M.; Xu, J.; Yang, J. Uncarboxylated Osteocalcin Decreases SCD1 by Activating AMPK to Alleviate Hepatocyte Lipid Accumulation. Molecules 2023, 28, 3121.
[13] Yan Q, et al. Autophagy activation contributes to lipid accumulation in tubular epithelial cells during kidney fibrosis [published correction appears in Cell Death Discov. 2019 Jul 10;5:116]. Cell Death Discov. 2018;4:2. Published 2018 Jun 27.
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