在腫瘤演化過程中，腫瘤始于單個或多個細胞的轉(zhuǎn)化，這些細胞通過隨機的突變形成克隆擴增，進而積累更多突變實現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化。但僅有少數(shù)克隆能轉(zhuǎn)化為惡性腫瘤，其背后的機制尚不清楚。

為了解答這一疑問，蘇黎世大學以及蘇黎世聯(lián)邦理工學院的聯(lián)合研究團隊開發(fā)了一種 CRISPR 策略，系統(tǒng)地記錄了在胚胎階段中的克隆擴情況，并揭示了腫瘤發(fā)生與克隆擴增密切的分子過程，相關(guān)內(nèi)容以 In vivo single-cell CRISPR uncovers distinct TNF programmes in tumour evolution 為題發(fā)表于 Nature。
 

驅(qū)動克隆擴增的突變集中于TNF信號通路
研究人員首先對 CROP-seq 系統(tǒng)進行了調(diào)整，將基因盒中的puromycin替換為mCherry熒光標記，并使用 TargetMol 的 5-ethynyl-2′-deoxyuridine（EdU）作為細胞增殖標記物，通過熒光激活細胞分選（FACS）選擇感染的細胞，從而實現(xiàn)對基因干擾的監(jiān)測和分析。然后通過子宮內(nèi)病毒微注射、單細胞 RNA 測序和導向捕獲（guide capture）等技術(shù)，系統(tǒng)地研究了 150 個常見的癌基因在克隆擴增和腫瘤發(fā)生中的作用。

在進行基因干擾后，對小鼠進行長期觀察，并收集樣本進行單細胞 RNA 測序。通過計算每個基因干擾對小鼠的表皮干細胞（EpSCs）的差異基因表達，發(fā)現(xiàn)許多 驅(qū)動克隆擴增的突變與腫瘤壞死因子（TNF）信號通路的基因表達高度相關(guān)。

例如，在 P60（小鼠出生后60天）細胞群的 44 個基因模塊中，占主導地位的一個主要基因模塊就包含了 25 個與 TNF 信號相關(guān)的基因。
 

▲上皮細胞的克隆擴增集中于TNF信號通路

小貼士
TNF 信號主要通過 TNF 配體與 TNF 受體1（TNFR1）結(jié)合激活，涉及 JUN 和 NF-κB 等轉(zhuǎn)錄因子。這些轉(zhuǎn)錄因子在細胞生長、免疫反應(yīng)和應(yīng)激反應(yīng)等多種生物過程中發(fā)揮重要作用。

為了測試 TNF 通路在上皮克隆擴增中的作用，研究人員使用超聲引導的子宮內(nèi)病毒微注射在胚胎中靶向 150 個癌基因，隨后，比較了在野生型和 Tnfrsf1a^+/− 小鼠 P60 皮膚中的擴張率。

結(jié)果顯示，在 P60 小鼠皮膚中，TNFR1 主要在 EpSCs 和毛囊干細胞中表達，幾乎所有的克隆擴增都高度依賴于 TNFR1，且高表達TNF基因模塊的克隆擴增率較高。

而 TNF 主要由巨噬細胞分泌，盡管在后天階段巨噬細胞的去除并未完全阻止克隆擴增，但它們在表皮的克隆擴增中起到了重要的促進作用。這表明巨噬細胞可能是 TNF 的一個重要來源。
 

▲克隆擴增是通過TNF介導的

自分泌的TNF基因程序
接下來，研究人員測試了 TNF 通路在克隆擴增與腫瘤演化中的作用。

通過在小鼠模型中注射靶向 150 個癌基因的 sgRNA 庫，并在特定時間點（P60）進行化學致癌處理，觀察腫瘤的形成和發(fā)展。然后使用單細胞RNA測序分析，識別出不同的腫瘤細胞群體，發(fā)現(xiàn)在 克隆擴增向腫瘤發(fā)生的轉(zhuǎn)變過程中，腫瘤細胞會下調(diào)用于克隆擴增的TNF模塊，并切換到自分泌TNF-MMP9和MMP10軸，促進上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的進展，使得腫瘤變得更具侵襲性。并且 TNF 特征與鱗狀細胞癌（squamous cell carcinoma, SCC）患者的較短總體生存期相關(guān)。
 

▲癌細胞切換到自分泌的TNF基因程序

小結(jié)
綜上，該研究建立了一個體內(nèi)單細胞 CRISPR 平臺，系統(tǒng)地解析了常見的 150 種癌基因在在克隆擴增和腫瘤發(fā)生中的作用。發(fā)現(xiàn) 腫瘤壞死因子（TNF）信號通路是介導克隆擴增的癌癥易感性的重要因素。

研究發(fā)現(xiàn)部分由巨噬細胞來源的 TNF 刺激的表皮干細胞（EpSCs）中的 TNF 信號基因模塊，是表型正常皮膚中克隆擴增的通用驅(qū)動因素。而在從克隆擴增到腫瘤發(fā)生的過渡過程中，這一信號模塊被下調(diào)，侵襲性癌細胞轉(zhuǎn)向一種與基質(zhì)重塑因子如 MMP9 和 MMP10 相關(guān)的自分泌 TNF 基因程序，以促進與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)的侵襲性特性。為開發(fā)新的癌癥預防和治療策略提供了基礎(chǔ)。
 

腫瘤進化中不同的TNF程序模型

科研助力

腫瘤壞死因子（TNF）是一種細胞信號蛋白（細胞因子），參與系統(tǒng)性炎癥，并且是急性期反應(yīng)中的細胞因子之一。它主要由活化的巨噬細胞產(chǎn)生，但也可以由許多其他細胞類型產(chǎn)生，如CD4+淋巴細胞、NK細胞、中性粒細胞等。當下，TNF相關(guān)研究如火如荼，TargetMol可提供多種TNF相關(guān)抑制劑、化合物庫以及重組蛋白助力相關(guān)研究，歡迎咨詢~

原文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41586-024-07663-y