以下文章來源于BiG生物創新社 ，作者BiG專欄

我們常說無論白貓黑貓，能抓到老鼠就是好貓。在下結論前，我們要給老鼠下個定義。我們要抓的是什么老鼠。今天抓得住的老鼠，我們明天還能抓得著嗎？這些要抓的老鼠的定義，可以從是商業及臨床的角度來下，也可以從技術角度來下。今天我們試圖從技術角度下手，來探討這個問題。希望從這個視角能引導我們走向下一個臨床的成功，并帶來商業上的成果。

如果ADC是一只貓，它的任務是去抓老鼠，第一只老鼠是療效（Efficacy Mouse; “EM”），還有兩只關于毒性的老鼠， 它們分別是脫靶毒性（Off-target toxicity; Toxicity Mouse 1;“TM1”）和在靶毒性（On-target toxicity; Toxicity Mouse 2;“TM2”）。我們今天來分析一下，目前的ADC，到底抓了那些老鼠。如果我們想找到一個規律，來提高未來的研發效率，還要探究一下，它們到底是白貓還是黑貓？是哪個貓抓了哪個老鼠？

2024年6月27日，田豐博士受邀請出席會議并做主題報告，本文為節選整理。文章僅供行業交流分享，不構成任何投資及用藥建議！

1.經歷了寒冬期和冰川期，近些年來ADC獲批密度越來越快，全球已有十幾種ADC藥物獲批上市（圖1），預計未來會有更多的ADC獲批上市。

圖1. 全球獲批上市的ADC藥物（截至2022）Adopted from Abzena Presentation

2.ADC由抗體、連接子和細胞毒素三部分組成，連接子包括可裂解和不可裂解連接子，細胞毒素包括微管抑制劑、微管穩定性破壞劑、DNA雙螺旋結構破壞劑、拓撲異構酶抑制劑等。ADC的偶聯方法也有很多，包括對天然抗體和工程化抗體進行修飾（圖2）。

圖2A：多種ADC偶聯方法（天然抗體）Adopted from Abzena Presentation

圖2B. 多種ADC偶聯方法（工程化抗體）Adopted from Abzena Presentation

3.ADC的主要挑戰是在維持一定抗癌活性的同時降低毒性

據計算，ADC藥物在進入人體后，只有大約0.1%的藥物能夠到達目標靶向的癌細胞，而絕大部分ADC會在人體內及健康細胞中分解(Nguyen)。這種“離位” 現象導致藥物產生毒性：一種是脫靶毒性（Off-target toxicity， TM1），另一種是在靶毒性（On-target toxicity, TM2）。

脫靶毒性：完整的ADCs可以通過非特異性內吞作用, 及與Fc/C型凝集素受體結合時的內化而被正常細胞吸收；或在血液及正常組織中，ADC的linker斷裂，釋放的有效載荷可以滲透通過細胞膜而被動擴散地進入正常細胞（圖3）。

在靶毒性：幾乎沒有僅在癌細胞上表達，而不在正常細胞中表達的ADC靶標。靶標不僅會在腫瘤細胞上表達，也會在正常細胞表達，只是或多或少的問題。當這些ADC靶向正常組織細胞上的靶標，而通過內吞，進入正常細胞時，就會引起在靶毒性。

圖3.毒性老鼠1 TM1(脫靶毒性) 和毒性老鼠2 TM2(在靶毒性)

4.ADC的治療效果及毒副作用主要由上述的療效、脫靶毒性、在靶毒性這三個方面綜合形成。 本文主要從技術上來分析形成機理，探討未來ADC的發展方向。

目前ADC大多用抗體上半胱氨酸的SH偶聯毒素上的馬來酰亞胺官能團。早前一直認為這個偶聯是穩定的。近些年來，新的實驗證據表明這個偶聯是可逆的，不穩定的。小分子藥物在人體血液中可以自動從抗體上脫落下來。

以Jackson等做的對照研究為例，可以看到，半胱氨酸偶聯的小分子藥物（橘黃色）是不穩定的，第5天時已經自行脫落近50%。而掉落的小分子藥物會馬上結合到人血清白蛋白（HSA）的半胱氨酸上。使用這種化學偶聯的小分子會在抗體和血清白蛋白間來回跳，巧妙地形成一種穩定的平衡。一旦沒有跳上抗體或HAS，游離的小分子就會被快速清除（圖4）。

圖4. 細胞毒素在ADC和HSA形成平衡

5.這種巧妙的平衡可能就發生在Enhertu上。Enhertu是目前最暢銷的ADC藥物，它的連接子是可裂解的。臨床發現，當它進入體內，ADC達到c-max時，小分子藥物也同時達到c-max。這意味著小分子藥物從ADC上的脫落，主要發生在血液循環中，在進入細胞之前。根據上述機理，脫落的小分子藥物很可能和HSA發生了結合（圖5）。

在體內，ADC上的小分子藥物，脫落的小分子藥物以及其與HSA結合的小分子藥物都貢獻了小分子毒素的類似緩釋的藥物動力學及血漿暴露量。 最近，Tarcsa等的分析文章指出，在人體中，許多ADC的脫落游離的小分子毒素濃度高于其IC50值（可以認為是藥物起效濃度）。如此，游離的DxD在一定程度上會在臨床呈現類似長效化療的療效及毒性。

圖5. Enhertu結構與PK性質

6.Enhertu是抗體與小分子上的馬來酰亞胺偶聯。而另一個HER2的ADC，T-DM1也使用這一化學來偶聯，只是方向是反過來的。T-DM1的細胞毒素上的SH與修飾過的抗體上的馬來酰亞胺偶聯。如此，當細胞毒素從抗體上自行脫落掉下來后，因沒有馬來酰亞胺官能團，無法與HSA結合，從而會像普通化療藥物一樣，被快速被排出人體，導致它的失去相當部分的由游離小分子造成的類似長效化療的藥效。如果當年Immunogen的科學家發明這個ADC時，把這個化學鏈接反過來，馬來酰亞胺不在抗體上，而是在小分子毒素一邊，T-DM1今天是否會有不同的療效和安全性的臨床表現，就不得而知了。（圖6）。

圖6. T-DM1結構與小分子PK性質

7.一般認為，ADC通過提高耐受劑量（MTD），降低起效劑量（MED）來拓寬治療窗口。而最近根據Colombo等的2022年的分析，其涵蓋了當時幾乎所有的ADC， ADC的MTD（有時用RP2D）跟其相對應的細胞毒素小分子的MTD是一樣的。不論什么ADC，什么靶點，什么抗體，都沒有提高小分子毒素的MTD，只提高了對癌細胞的ADC的活性（MED）（圖7）。根據他們的觀察而得出的結論是，使用同一技術的ADC，無論抗體針對靶點如何變化，抗體如何變化， 其MTD都是都是一樣的。然而，最近公布臨床數據，卻展示了一個例外。ARX788 的RP2D為1.5 或1.7 mg/kg； 而使用完全一樣技術的ARX517，目前在一期臨床已經爬到2.88 mg/kg, 而且劑量還在繼續爬升。這與Colombo的模型不符。我們不禁要問，為什么呢？

圖7. 對當前ADC的MTD的解析

8.ARX788 是定點偶聯 HER2 ADC，它使用獨特的非天然氨基酸結合技術和不可切割的藥物接頭偶聯而得。 其與Enhertu和T-DM1的小分子毒素的PK不同。Enhertu和T-DM1進入體內后小分子藥物的峰值立即出現，而ARX788進入體內后小分子毒素與非天然氨基酸的偶合物的濃度很低，而且緩慢爬升，其峰值直到五天或七天之后才達到。說明小分子藥物在血液中釋放的很少， 藥物的釋放是ADC進入細胞后，經過溶酶體降解才釋放出來。這會降低由游離小分子造成的脫靶毒性（圖8）。Colombo 的模型之所以可以解釋當前幾乎所有的ADC，而不能解釋ARX788和ARX517，是因為Colombo的模型所適用的是，本身具有的相當的長效化療成分性質的ADC。它們的MTD（有時用RP2D）是由釋放的游離小分子毒素主導的。所以，這類ADC臨床呈現的MTD，與其相對應的細胞毒素小分子的MTD一致，是理所當然的。Ambrx技術平臺上的兩款ADC，基本上沒有或很少有長效化療的性質成分，所以無法用Colombo的模型來解釋。

圖8. ARX788結構與PK性質（Ambrx public information）

9.研發ADC是一項復雜的工程，要綜合靶標、適應癥、偶聯方法，小分子藥物、連接子和抗體等多種要素。目前的ADC大面上有兩類路線。第一類路線，也是目前最普遍的，使用可斷裂鏈，兼備長效的化療性質（L）及ADC靶向遞送（A）的ADC，以Enhertu為代表（圖10）。其療效和毒性由L及A共同提供。其L和A的成分比重，由可斷裂鏈的穩定性的高低來調節。就臨床展現的毒性來講， 較不穩定的linker的ADC，其毒性呈現會更像化療般的脫靶毒性， 比如Tredolvy；較穩定的linker的ADC，其毒性呈現會偏向脫靶毒性加上在靶毒性。從技術角度來分析，這類ADC應該是既沒有抓住毒性的第一只老鼠（TM1，脫靶毒性），也沒有抓住第二支關于毒性的老鼠（TM2，在靶毒性）。它既不是白描（A），也不是黑貓（L），更像一只灰貓。目前臨床上，絕大多數ADC所呈現的毒性為類似化療的系統性脫靶毒性。展望未來，這種用調節linker 的穩定性，在A和L 間玩平衡的游戲的技術走向， 目前還看不清楚（圖10）。這一類ADC目前屬于主流，而且取得了商業上的巨大成功。

此外，也有團隊在這一類ADC平臺的基礎上，設計各類活性開關，試圖來解決在靶毒性問題（圖9）。但到目前為止，在臨床上，這一問題還有待突破（Liu） 。

圖9 試圖解決實體瘤在靶毒性問題的ADC設計

10.第二類路線的ADC，為數不多，以ARX788和ARX517為代表，使用不可斷裂連。這種ADC的長效化療的性質（L）幾乎沒有，主要呈現為ADC靶向遞送（A）的ADC。就毒性來講， 脫靶毒性問題得到部分緩解：其由小分子脫落造成的脫靶毒性問題得以解決，而由非特異細胞內吞造成的脫靶毒性， 還有待觀察。和第一類ADC相比，這類ADC，更像一只白貓（A）。 它部分緩解了脫靶毒性問題，抓住了毒性的第一只小老鼠 （脫靶毒性的老鼠，TM1）；沒有抓住第二支關于毒性的老鼠（TM2，在靶毒性）。對這類ADC而言，如果腫瘤靶點在某些正常組織中有相當程度的表達，在靶毒性會是一個嚴峻的挑戰。ADC的在靶毒性（TM2）問題，相較與脫靶毒性（TM1）問題，在難度上要大很多（Liu）。即便如此，對這第二類ADC的未來技術走向，我認為應該是往前走，迎著困難上，去解決在靶毒性問題。在第一類ADC平臺基礎上，那只灰貓未能解決的在靶毒性問題，或許是第二類ADC平臺，這只白貓的一個機遇（圖10）。

圖10 ADC當下勢態和未來走向

主要參考文獻
1.Raffaele Colombo and Jamie R. Rich, “The therapeutic window of antibody drug conjugates: A dogma in need of revision”, Cancer Cell, 40, November 14, 2022, 1225.2.Tarcsa E, et al. “Antibody-drug conjugates as targeted therapies: Are we there yet? A critical review of the current clinical landscape”, Drug Discov Today: Technol (2020).3.Toan D. Nguyen, Brandon M. Bordeau and Joseph P. Balthasar， “Mechanisms of ADC Toxicity and Strategies to Increase ADC Tolerability”, Cancer, 2023, 15, 713.4.Dowdy Jackson, et al. “In Vitro and In Vivo Evaluation of Cysteine and Site Specific Conjugated Herceptin Antibody-Drug Conjugates”, PLOS ONE, 2014 , Volume 9 , Issue 1 , e83865.5.Yutong Liu et al, “Engineering antibodies for conditional activity in the solid tumor microenvironment”,