為更好滿足AAV病毒純化過程中高鹽環境對全能核酸酶的活性要求， 逐典生物自主開發出耐高鹽版本全能核酸酶，在高鹽條件下，仍具有高酶活，是AAV病毒生產及其它生物工藝流程中去除核酸污染的理想選擇。
 

基因治療是一種利用基因治療載體將外源的治療性基因轉導至細胞，通過外源基因的轉錄和翻譯，改變細胞原有基因表達以治療疾病的方法。腺相關病毒（AAV）載體具有不整合宿主基因組、靶向組織特異性等核心優勢成為最通用和最成功的基因治療遞送載體之一。隨著AAV基因治療的研究從實驗室開發轉向臨床規模化生產，AAV病毒載體的上游生產和下游純化過程仍然面臨重要挑戰。
 

AAV gene transfer therapy mechanism of action. Mol Ther Methods Clin Dev. 2022;25:74-83.

一，AAV病毒的工業生產

AAV病毒載體的生產流程跟抗體、疫苗類藥物的生產類似，主要包含上游培養、下游純化以及制劑部分。其中，病毒生產流程的后半部分需要從工藝和產品相關的雜質中純化病毒顆粒，這些下游處理步驟可能占病毒生產總成本的很大一部分，因此高效地產生高純度病毒非常重要。一般下游操作主要包括：(1)用去污劑、機械作用、高滲或凍融操作裂解細胞釋放病毒；(2)核酸去除，裂解物經全能核酸酶消化以減少核酸污染物；(3)在色譜純化前通過離心或微濾去除細胞碎片和碎片；(4)親和層析，去除宿主細胞蛋白(HCPs)和任何血清蛋白雜質；(5)用氯化銫梯度超離心法從空殼病毒、非感染性病毒中分離包含全基因的完整病毒顆粒。

Timeline for GMP manufacture of AAVs – Example

二，常規全能核酸酶在AAV生產中的作用和限制

根據WHO和各國藥物注冊監管機構要求，生物制劑中殘留的宿主DNA的劑量不得超過100 pg/劑量，部分特殊情況下不得高于10 ng/劑量，基于此，常使用全能核酸酶應用于生產工藝流程中來去除核酸污染。在AAV病毒生產中，經宿主細胞大量擴增，在細胞裂解后，往往需要加入全能核酸酶來去除核酸污染，同時可以降低粘樣品稠度，便于后續上柱純化。值得注意的是，在AAV病毒純化過程中，為提高病毒收率，常使用含有較高鹽濃度的buffer（400-500mM），而常規版本全能核酸酶的酶活會隨著鹽濃度升高而急劇下降，實際使用中，常需要通過增加酶的用量或延長孵育時間來提高純化效果，但這無疑增加了AAV純化成本和工藝復雜度。

宿主核酸與AAV病毒纏繞在一起，影響核酸酶的酶切效果

實際上，鹽是各種純化方案的重要組成部分，鹽濃度的提高可有效地減少AAV病毒顆粒的聚集，提高AAV病毒顆粒產率。
 

三，逐典耐高鹽核酸酶應用案例：