載體和目的片段的酶切實驗步驟
A 載體和外源DNA的酶切
一、實驗?zāi)康?/strong>
學習和掌握核酸的酶切操作原理；通過酶切獲得可進行體外重組的載體和外源DNA。
二、實驗原理
限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點上，并切割雙鏈DNA。絕大多數(shù)限制酶識別長度為4至6個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列(如EcoRⅠ識別六個核苷酸序列：5'- G↓AATTC-3')，有少數(shù)酶識別更長的序列或簡并序列。Ⅱ類酶切割位點在識別序列中，有的在對稱軸處切割，產(chǎn)生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3')；有的切割位點在對稱軸一側(cè)，產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性未端，如EcoRⅠ切割識別序列5'…G↓AATTC…3' 后產(chǎn)生兩個互補的粘性末端。
限制性內(nèi)切酶的酶解反應(yīng)最適條件各不相同，各種酶有其相應(yīng)的酶切緩沖液和最適反應(yīng)溫度(大多數(shù)為37℃)。對質(zhì)粒DNA酶切反應(yīng)而言， 限制性內(nèi)切酶用量可按標準體系1μg DNA加1單位酶，消化1-2小時。但要完全酶解則必須增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反應(yīng)時間也要適當延長。
酶活力通常用酶單位（U）表示，酶單位的定義是：在最適反應(yīng)條件下，1小時完全降解1mg λDNA的酶量為一個單位，但是許多實驗制備的DNA不象λDNA那樣易于降解，需適當增加酶的使用量。反應(yīng)液中加入過量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質(zhì)可能干擾隨后的反應(yīng)。
三、主要試劑
質(zhì)粒pET30a、EcoRⅠ、HindⅢ、DNA產(chǎn)物純化kit、無菌水、乙醇、瓊脂糖、溴酚藍、TAE、EB、DNA marker、NaAc
四、儀器耗材
水浴鍋、滅菌鍋、離心機、電泳儀、電泳槽、凝膠成像儀、移液槍一套、微波爐。
五、酶切反應(yīng)
反應(yīng)體系 1. 質(zhì)粒 3
bf 2
EcoRⅠ 1 (10U/μL)
Hind Ⅲ 1 (10U/μL)
H2O 13
---------------------------------------
Total 20 μL
反應(yīng)體系 2. PCR產(chǎn)物 10 (50ng/μL) （回收后的PCR產(chǎn)物）
bf 5
EcoRⅠ 1 (10U/μL)
Hind Ⅲ 1 (10U/μL)
H2O 33
----------------------------------------
Total 50 μL
37℃，2-4hr； 65℃，10min，終止反應(yīng)。
質(zhì)粒載體酶解液，瓊脂糖膠電泳檢測。切膠回收。
PCR產(chǎn)物酶切后不用回收，直接用于連接。可以電泳檢測回收效果。
六、注意事項
一、實驗?zāi)康?/strong>
學習和掌握核酸的酶切操作原理；通過酶切獲得可進行體外重組的載體和外源DNA。
二、實驗原理
限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點上，并切割雙鏈DNA。絕大多數(shù)限制酶識別長度為4至6個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列(如EcoRⅠ識別六個核苷酸序列：5'- G↓AATTC-3')，有少數(shù)酶識別更長的序列或簡并序列。Ⅱ類酶切割位點在識別序列中，有的在對稱軸處切割，產(chǎn)生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3')；有的切割位點在對稱軸一側(cè)，產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性未端，如EcoRⅠ切割識別序列5'…G↓AATTC…3' 后產(chǎn)生兩個互補的粘性末端。
限制性內(nèi)切酶的酶解反應(yīng)最適條件各不相同，各種酶有其相應(yīng)的酶切緩沖液和最適反應(yīng)溫度(大多數(shù)為37℃)。對質(zhì)粒DNA酶切反應(yīng)而言， 限制性內(nèi)切酶用量可按標準體系1μg DNA加1單位酶，消化1-2小時。但要完全酶解則必須增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反應(yīng)時間也要適當延長。
酶活力通常用酶單位（U）表示，酶單位的定義是：在最適反應(yīng)條件下，1小時完全降解1mg λDNA的酶量為一個單位，但是許多實驗制備的DNA不象λDNA那樣易于降解，需適當增加酶的使用量。反應(yīng)液中加入過量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質(zhì)可能干擾隨后的反應(yīng)。
三、主要試劑
質(zhì)粒pET30a、EcoRⅠ、HindⅢ、DNA產(chǎn)物純化kit、無菌水、乙醇、瓊脂糖、溴酚藍、TAE、EB、DNA marker、NaAc
四、儀器耗材
水浴鍋、滅菌鍋、離心機、電泳儀、電泳槽、凝膠成像儀、移液槍一套、微波爐。
五、酶切反應(yīng)
反應(yīng)體系 1. 質(zhì)粒 3
bf 2
EcoRⅠ 1 (10U/μL)
Hind Ⅲ 1 (10U/μL)
H2O 13
---------------------------------------
Total 20 μL
反應(yīng)體系 2. PCR產(chǎn)物 10 (50ng/μL) （回收后的PCR產(chǎn)物）
bf 5
EcoRⅠ 1 (10U/μL)
Hind Ⅲ 1 (10U/μL)
H2O 33
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Total 50 μL
37℃，2-4hr； 65℃，10min，終止反應(yīng)。
質(zhì)粒載體酶解液，瓊脂糖膠電泳檢測。切膠回收。
PCR產(chǎn)物酶切后不用回收，直接用于連接。可以電泳檢測回收效果。
六、注意事項
- DNA純度、緩沖液、溫度條件及限制性內(nèi)切酶本身都會影響限制性內(nèi)切酶的活性。大部分限制性內(nèi)切酶不受RNA或單鏈DNA的影響。當微量的污染物進入限制性內(nèi)切酶貯存液中時，會影響其進一步使用，因此在吸取限制性內(nèi)切酶時，每次都要用新的吸管頭。
- 限制性內(nèi)切酶一旦拿出冰箱后應(yīng)當立即置于冰上。酶應(yīng)當是最后一個被加入到反應(yīng)體系中（在加入酶之前所有的其它反應(yīng)物都應(yīng)當已經(jīng)加好并已預混合）。
- 10×bf工作濃度為1×，注意混勻。
- 酶切時所加的DNA溶液體積不能太大，否則DNA溶液中其他成分會干擾酶反應(yīng)。
- 酶通常保存在50%的甘油中，實驗中，應(yīng)將反應(yīng)液中甘油濃度控制在1/10之下，否則，酶活性將受影響。
- 如果反應(yīng)較長時間而酶切體系又很小比如10微升，那么哪怕用PCR小管做反應(yīng)，體積損失也會很大。采用石蠟油覆蓋的方法可避免水分損失甘油濃度提高而引起的星活性。& O; c$ } H8
- 混合：這是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反應(yīng)完全，必須使反應(yīng)液充分混合。我們推薦用槍反復吸取混合，或是用手指輕彈管壁混合，然后再快速離心一下即可。注意：不可振蕩。
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