細(xì)胞培養(yǎng)在科研和生物制藥中被廣泛應(yīng)用，支原體污染問題頻繁出現(xiàn)，污染會(huì)影響細(xì)胞的生長、形態(tài)、生化特點(diǎn)和遺傳特征。因此，為了提高生物制品的有效性和安全性，各國監(jiān)管機(jī)構(gòu)和法規(guī)都建議使用適當(dāng)?shù)臋z測方法對細(xì)胞進(jìn)行檢測，以確保使用的細(xì)胞無支原體污染。
 

迄今為止，已經(jīng)有多種支原體檢測方法，包括培養(yǎng)法、指示細(xì)胞法、基于核酸擴(kuò)增（NAT）的方法和基于酶促反應(yīng)的方法（生化法），每種方法都有各自的特點(diǎn)和應(yīng)用范圍。培養(yǎng)法作為經(jīng)典方法，通過有無支原體生長進(jìn)行判斷，最直接，但是檢測時(shí)間是一個(gè)最大的挑戰(zhàn)；指示細(xì)胞法檢測時(shí)間稍微有所縮短，但是靈敏度是一個(gè)問題。NAT方法檢測時(shí)間短，是直接對支原體的核酸進(jìn)行擴(kuò)增，但是覆蓋率和準(zhǔn)確度以及對死活支原體的區(qū)分有一定的挑戰(zhàn)；基于酶促反應(yīng)的生化法檢測的時(shí)間最短，對活的支原體進(jìn)行檢測，靈敏度適中。
 

生化法是基于支原體的生化活性的檢測方法，相關(guān)試劑盒可檢測支原體酶，如乙酸激酶和氨基甲酸酯激酶。這些酶能夠在磷酸乙酰基和磷酸氨基甲酰基底物存在下催化ADP轉(zhuǎn)化為ATP，進(jìn)而在熒光素酶作用下使得熒光素底物反應(yīng)釋放化學(xué)發(fā)光信號。靈敏度較高、準(zhǔn)確、特異和快速（20mins）是生化法檢測的主要優(yōu)點(diǎn)。推薦用于細(xì)胞、培養(yǎng)基、血清等樣品的快速污染檢測和篩查。
 

生化法檢測原理：

表1常見三種支原體檢測方法的比較
 

題為“Sensitivityof biochemical test in comparison with other methods for thedetection of mycoplasma contamination in human and animal cell linesstored in the National Cell Bank of Iran"論文采用培養(yǎng)法、生化法（LonzaMycoAlert®試劑盒）和PCR法對細(xì)胞庫大量的細(xì)胞進(jìn)行污染檢測，并對這些方法的敏感性、特異性、準(zhǔn)確性和便捷性（速度）進(jìn)行了比較，認(rèn)為MycoAlert生化法由于其靈敏度、特異性和檢測速度的多方面優(yōu)勢，可被視為傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)和DNA染色熒光染料方法的替代方法。這與美國藥典（USP）的描述內(nèi)容一致，“Avalidated nucleic acid amplification technique(NAT) or an enzymaticactivity based method may be used to detect Mycoplasma"。
 

該研究中，研究人員隨機(jī)選取了40種不同的人和動(dòng)物細(xì)胞系，分別以Vero和NSO細(xì)胞系為陽性和陰性對照，使用培養(yǎng)法、生化法和PCR方法進(jìn)行支原體檢測。結(jié)果匯總?cè)缦拢?br />  

表2三種方法檢測結(jié)果

檢測結(jié)果進(jìn)行SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并以培養(yǎng)法為參照，計(jì)算陽性和陰性結(jié)果的敏感性、特異性、準(zhǔn)確性和預(yù)測值，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖1。
 

圖1.三種支原體檢測方法在特異性、敏感性和準(zhǔn)確性參數(shù)上的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較

由此結(jié)果可以看出：生化法具有出色的靈敏度、準(zhǔn)確度、特異性，而且檢測時(shí)間短（＜20mins），可以成為培養(yǎng)法和染色法的較好替代。該方法只能檢測活的支原體，因此可以跟PCR法形成較好的檢測互補(bǔ)。
 

研究中所使用的生化法試劑盒MycoAlert來自于Lonza,作為業(yè)內(nèi)經(jīng)典的生化法支原體檢測試劑盒，其檢測靈敏度為＜50cfu/mL，對A.laidlawii、M.hyorhinis和M.orale的靈敏度為10~20cfu/mL。
 

圖2.MycoAlert®試劑盒檢測示意圖和靈敏度結(jié)果

目前Lonza已經(jīng)推出了升級版本的支原體試劑盒MycoAlert®Plus，除了可以在Lonza Lucetta™ 2檢測設(shè)備之外，由于其更佳的檢測靈敏度，還可以使用各種酶標(biāo)儀進(jìn)行高通量支原體檢測。