銳博生物 Oncogene：miR-374a反饋環(huán)抑制鼻咽癌

方唯意教授研究團隊近日又在Oncogene上發(fā)文證實了受PDCD4調(diào)節(jié)的miR-374a-CCND1-pPI3K/AKT-c-JUN反饋環(huán)能抑制鼻咽癌細胞生長與代謝。讓我們看看這次的研究思路與結(jié)果吧。

實驗思路與方法

miR-374a對NPC細胞的抑制作用

圖1

與陰性對照組相比，miR-374a mimic抑制細胞生長（圖1a），阻礙G1/S細胞周期過渡（圖1b），還會減少細胞代謝與入侵，此外，miR-374a過表達能增強NPC細胞對DDP的化學敏感性。反之，用抑制劑敲除miR-374a后顯著恢復。但是，經(jīng)FACS分析檢測，miR-374a不誘導細胞凋亡。隨后在通過小鼠體內(nèi)實驗驗證了上述結(jié)論（圖1c）。

miR-374a與細胞信號

研究者通過實驗觀察到miR-374a不僅抑制pPI3K（Tyr458），pAKT（Ser473）和c-JUN表達，而且顯著減少細胞周期相關基因的表達，如CCND1，c-MYC.同時，包括Snail與N-cadherin在內(nèi)的間葉細胞相關基因表達也下降了，而上皮標記物E-cadherin的表達量則出現(xiàn)了增幅，但是細胞凋亡相關蛋白PDCD4并不受miR-374a的異常表達影響。概括來說，這些數(shù)據(jù)表明miR-374a抑制PI3K/AKT,細胞信號與EMT（Epithelial-MesenchymalTransition），但不調(diào)節(jié)NPC的細胞凋亡。

CCND1的身份與作用

通過miRwalk與RNAhybrid演算法，預測CCND1與c-MYC是miR-374a的直接靶標。用熒光素酶報告基因?qū)嶒炁c共轉(zhuǎn)染實驗證明在NPC細胞中，CCND1,而不是c-MYC，是miR-374a的靶標；它還能顯著減少miR-374a的表達，還增強了細胞生長，代謝與侵襲性，降低了細胞對DDP的敏感性。隨后，研究者發(fā)現(xiàn)在CCND1被敲除后，會出現(xiàn)與miR-374a過度表達后觀察到的現(xiàn)象。此外，在NPC細胞中，siRNA對c-MYC的抑制降低了pPI3K與pAKT的表達量，而CCND1的抑制誘導了miR-374a的表達。這表明CCND1通過c-MYC激活PI3K/AKT通道，但其發(fā)生機理不明確。

c-JUN：關鍵第四號

圖3

研究者通過生物信息學推測PI3K/AKT途徑通過調(diào)控c-JUN降低miR-374a表達。實驗表明，減弱PI3K的磷酸化作用可減少了pAKT與c-JUN的表達（圖3a）同時刺激了miR-374a的表達（圖3b），而敲除c-JUN（圖3c）誘導miR-374a的表達（圖3d），這表明c-JUN是miR-374a的上游調(diào)控者。隨后我們使用染色質(zhì)免疫沉淀結(jié)合qPCR分析法發(fā)現(xiàn)c-JUN上調(diào)會使野生型miR-374a啟動子熒光素酶活性降低，且在NPC細胞中c-JUN的抑制降低了CCND1的表達（圖3c）。

PDCD4如何抑制 NPC 細胞活動？

研究者通過實驗證明了在5-8F細胞中PDCD4過表達顯著降低細胞遷移與侵襲性，同時降低EMT-相關基因的表達，而在PDCD4正常表達的SUNE1與HONE1細胞中觀察到相反的結(jié)果。這表明PDCD4通過EMT信號抑制細胞代謝與入侵。
 

miR-374a：我要插腳PDCD4調(diào)節(jié)

在此研究中，他們發(fā)現(xiàn)并證實在shPDCD4 NPC細胞中miR-374a顯著下調(diào)，且在PDCD4過表達時出現(xiàn)相反的影響，而c-JUN直接抑制miR-374a表達。此外還發(fā)現(xiàn)在PDCD4過表達的5-8F NPC細胞中，結(jié)合到miR-374a啟動子上的c-JUN會顯著減少。抑制miR-374a可部分恢復CCND1與pPI3K水平，同時總PI3K或PDCD4在c-JUN敲除后未出現(xiàn)改變。這些數(shù)據(jù)表明PDCD4通過PI3K/AKT/c-JUN途徑誘導miR-374a表達。

捋捋三角關系

圖4

接著，他們嘗試著理清miR-374a, PDCD4與CCND1之間mRNA水平的關系。相比起正常鼻咽（NP）組織，NPC樣本中的miR-374a（圖4a，1）與PDCD4（圖4a，3）的表達水平下降，而在癌癥組織中CCND1顯著下降（圖4a，2）。這說明miR-374a表達與CCND1表達成負相關（圖4b，1）且與PDCD4表達成正相關（圖4b，2）。此外，經(jīng)統(tǒng)計分析表明，CCND1表達與PDCD4表達呈負相關（圖4b，3）。他們還做了存活分析，得出高CCND1、低PDCD4表達的患者預后性更差，反之，低CCND1、高PDCD4表達的患者存活時間更長（圖4c）。

這篇文章的總體實驗思路與之前的那篇文章的基本相同，綜合兩篇文章來看，我們不難發(fā)現(xiàn)miRNA在癌變過程中作為致癌基因或腫瘤抑制劑，扮演了一個舉足輕重的角色。因此，了解每一個miRNA的功能及其表達圖譜將會幫助我們驗證它們作為診斷標志的作用并提供癌癥治療的治療靶標。miR-374a最初是作為某些腫瘤的致癌基因被報道的，但在此文章以及其他文章報道中則有相反的結(jié)果，這說明miRNA的分子功能與基礎都是極其復雜與矛盾的，不能一概而論，同時鼓勵我們進行更多的研究來探索每個miRNA在特定環(huán)境中的作用。

原文：miR-374a-CCND1-pPI3K/AKT-c-JUN feedback loop modulated by PDCD4 suppresses cell growth, metastasis, and sensitizes nasopharyngeal carcinoma to cisplatin

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