動物胸腺上皮細胞的培養(yǎng)

瀏覽次數(shù)：3300　發(fā)布日期：2010-8-11　來源：www.pricells.com.cn

正常動物胸腺上皮細胞的培養(yǎng)

實驗材料：

1. 胸腺上皮細胞來源；一般取材小鼠或手術(shù)切取的兒童之胸腺；

2. 不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素，pH7.2；

3. 有血清培養(yǎng)液：可使用RPMI1640培養(yǎng)液，添加10%胎牛血清、谷氨酰胺2mmol/L、丙酮酸鈉1mmol/L、非必需氨基酸1mmol/L、2-巰基乙醇（2-ME）5×10^-5 mol/L、青霉素100IU/ml、鏈霉素100μg/ml（Schreiber et al.1991）。也可以DMEM作為基礎培養(yǎng)基；

4. 化學限定性培養(yǎng)液：基礎培養(yǎng)液為DMEM，添加HDL100μg/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白50μg/ml、胰島素5μg/ml、氫化可的松2.7×10^-7 mol/L、EGF 10ng/ml、硒25 ng/ml以及三碘甲腺原氨酸（T3）1×10-¹⁰mol/L（Schreiber et al.1991）；

5. 消化液：原代培養(yǎng)時，從胸腺組織制備細胞懸液時，所用的消化液為1mg/ml的膠原酶，用含有15%胎牛血清的DMEM配制。傳代時所用的消化液為0.02%EDTA-0.25%胰蛋白酶混合液；

6. 手術(shù)刀、解剖剪、解剖鑷、眼科剪，眼科鑷，止血鉗，無菌消毒手術(shù)器械；

7. 離心管（15ml、50ml）

實驗方法：

1. 若取材于小鼠，先將動物處死，用75%乙醇消毒。打開胸腔，取出胸腺。如果取材于手術(shù)切除的兒童胸腺，將所取胸腺組織置于含抗生素的平衡鹽溶液中；

2. 將切取的胸腺組織盡可能去除表面的結(jié)締組織被膜。將胸腺實質(zhì)剪成約1mm3大小的植塊；

3. 用平衡鹽溶液反復洗滌植塊，以盡量洗去胸腺細胞；

4. 在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，用膠原酶消化液消化約1.5h；

5. 在膠原酶消化液中，將組織塊進一步剪碎；

6. 靜置，待組織塊下沉，棄去上清液。將組織塊重新懸浮于無血清培養(yǎng)液中；

7. 重復步驟5可達3次；

8. 將將植塊接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿內(nèi)，置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)器皿可以用生長基質(zhì)物質(zhì)預先包被。在原代培養(yǎng)最初6d內(nèi)，不更換培養(yǎng)液；