新一代毒液組學(xué)測序：多酶切方法在蛇毒鑒定領(lǐng)域的應(yīng)用
蛇毒中毒，尤其是蛇咬傷中毒已被世界衛(wèi)生組織定義為最容易被忽視的熱帶病之一，也是全球性的公共衛(wèi)生問題[1]，因此尋求深度鑒定和表征毒液毒素的研究方法非常重要。事實上，在過去十年中，毒液研究取得的突破很大程度上是由于組學(xué)技術(shù)在毒液和毒腺成分的定性和定量分析中的發(fā)展和應(yīng)用，并將這種應(yīng)用于毒液的綜合工作流程稱為“毒液組學(xué)”[2]。
蛋白質(zhì)組學(xué)研究在動物毒液中發(fā)現(xiàn)的多種選擇性和強(qiáng)效天然產(chǎn)物的復(fù)雜混合物，作為潛在治療方案的溯源指導(dǎo)起到了重要作用。此外，了解動物毒液的可變成分對于了解毒液變異的進(jìn)化過程，設(shè)計特異性更強(qiáng)的抗蛇毒血清來對抗中毒后的病理效應(yīng)至關(guān)重要[3]。通常，毒液主要由5 KDa至100 KDa以上分子量的多肽組成，并且某些物種的特定毒素具有序列特異性。某些眼鏡蛇科的蛇毒中，作為主要成分的毒素，即kunitz型毒素，含有豐富的堿性氨基酸殘基。由于胰蛋白酶主要在K和R殘基的C端末端切割，因此會產(chǎn)生過度酶切，導(dǎo)致毒素的序列覆蓋率下降，數(shù)據(jù)分析出現(xiàn)偏差。
法國里昂大學(xué)分子系統(tǒng)研究中心質(zhì)譜實驗室的研究團(tuán)隊在Toxins發(fā)表了文章 “Next-Generation Sequencing for Venomics: Application of Multi-Enzymatic Limited
Digestion for Inventorying the Snake Venom Arsenal”，首次探索了多酶限時酶切（MELD）方法在蛇毒特征分析中的應(yīng)用，使用兩個蛇科(Elapidae和Viperidae)的四種蛇毒液作為模型，并證明了MELD相對于傳統(tǒng)的自下而上的蛋白質(zhì)組學(xué)方法的可行性和優(yōu)勢。質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析使用PEAKS®️ Studio完成。
蛋白質(zhì)組學(xué)研究在動物毒液中發(fā)現(xiàn)的多種選擇性和強(qiáng)效天然產(chǎn)物的復(fù)雜混合物，作為潛在治療方案的溯源指導(dǎo)起到了重要作用。此外，了解動物毒液的可變成分對于了解毒液變異的進(jìn)化過程，設(shè)計特異性更強(qiáng)的抗蛇毒血清來對抗中毒后的病理效應(yīng)至關(guān)重要[3]。通常，毒液主要由5 KDa至100 KDa以上分子量的多肽組成，并且某些物種的特定毒素具有序列特異性。某些眼鏡蛇科的蛇毒中，作為主要成分的毒素，即kunitz型毒素，含有豐富的堿性氨基酸殘基。由于胰蛋白酶主要在K和R殘基的C端末端切割，因此會產(chǎn)生過度酶切，導(dǎo)致毒素的序列覆蓋率下降，數(shù)據(jù)分析出現(xiàn)偏差。
法國里昂大學(xué)分子系統(tǒng)研究中心質(zhì)譜實驗室的研究團(tuán)隊在Toxins發(fā)表了文章 “Next-Generation Sequencing for Venomics: Application of Multi-Enzymatic Limited
Digestion for Inventorying the Snake Venom Arsenal”，首次探索了多酶限時酶切（MELD）方法在蛇毒特征分析中的應(yīng)用，使用兩個蛇科(Elapidae和Viperidae)的四種蛇毒液作為模型，并證明了MELD相對于傳統(tǒng)的自下而上的蛋白質(zhì)組學(xué)方法的可行性和優(yōu)勢。質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析使用PEAKS®️ Studio完成。
圖1 實驗設(shè)計
首先作者各選取了眼鏡蛇科和蝮蛇科的2種蛇，提取毒液后分別使用傳統(tǒng)胰酶單一酶切（TRYP）和多酶限時酶切（MELD）兩種方法進(jìn)行處理，酶切產(chǎn)物采集了MALDI TOF PMF圖譜，發(fā)現(xiàn)總體上不同酶切方法對離子采集數(shù)量影響不是很大，但MELD的酶切產(chǎn)物的響應(yīng)強(qiáng)度有所提高（圖2）。
圖2 不同酶切處理的PMF采集對比
然后，作者采集了LC-MS/MS數(shù)據(jù)，用PEAKS®️ Studio X+完成數(shù)據(jù)庫檢索和de novo測序分析。在DB search的結(jié)果中，TRYP處理的樣本平均鑒定到506（±198）條多肽，MELD則是1130（±705），提升了約2.2倍（圖3A），并且圖3A僅統(tǒng)計的是unique peptides。De novo肽段數(shù)量也有顯著提升，可以幫助發(fā)現(xiàn)更多參考物種庫里面缺失的信息或者未知的翻譯后修飾（圖3B）。
圖3 LC-MS/MS肽段鑒定結(jié)果
接下來，又從多肽、蛋白水平比較了兩種酶切方法的效果（圖2B-D），基本上與圖1結(jié)果一致，即MELD酶切效果更好。但只有DpV的樣本趨勢不同，結(jié)合SDS-PAGE結(jié)果（圖4A），推測可能是因為其蛋白主成分主要為6-14KDa的小分子量蛋白，所以酶切位點(diǎn)相對其他樣本更少。
圖4 多肽序列、蛋白鑒定結(jié)果比較
最后，作者根據(jù)Damm et al.[4] 和Boldrini-França et al.[5]對毒液成分的分組規(guī)則進(jìn)行了本次鑒定結(jié)果的蛋白成分分析。結(jié)果表明（圖5），這兩種方法在每種毒液中都鑒定到了大多數(shù)毒素蛋白，且MELD處理的毒液鑒定到的主要毒素比例更高，且細(xì)胞成分比例更低。值得注意的是，盡管DpV的樣本用兩種酶處理鑒定出的總蛋白數(shù)差別不大，但是使用MELD鑒定出的主要毒素蛋白的比例顯著提高了（30.4%至47.6%）。并且，也比較了四種主要毒素的序列覆蓋度，MELD處理能達(dá)到更高的氨基酸覆蓋率（表1）。因此表明MELD方法提高了毒素鑒定的多樣性，從而可以幫助提高毒素庫的覆蓋深度。
圖5 毒液成分分析
表1 主要毒素覆蓋率
總之，借助Trypsin+GluC+Chymotrypsin的多酶限時酶切（MELD）方法，提高了蛇毒蛋白的鑒定數(shù)量、序列覆蓋度，并可以幫助鑒定毒液成分的新群體，增加毒素的深度測序。(原文鏈接:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10304959/)
參考文獻(xiàn)
1. WHO. Snakebite Envenoming. World Health Organization (WHO). Available online: https://www.who.int/health-topics/snakebite#tab=tab_1 (accessed on 4 April 2023).
2. Calvete, J.J.; Sanz, L.; Angulo, Y.; Lomonte, B.; Gutiérrez, J.M. Venoms, venomics,
antivenomics. FEBS Lett. 2009, 583, 1736–1743.13.
3. Casewell, N.R.; Jackson, T.N.W.; Laustsen, A.H.; Sunagar, K. Causes and Consequences of Snake Venom Variation. Trends Pharmacol. Sci. 2020, 41, 570–581.
4. Damm, Maik, Benjamin-Florian Hempel, and Roderich D. Süssmuth. 2021. "Old World Vipers—A Review about Snake Venom Proteomics of Viperinae and Their Variations" Toxins 13, no. 6: 427. https://doi.org/10.3390/toxins13060427
5. Boldrini- França, J.; Cologna, C.T.; Pucca, M.B.; Bordon, K.D.C.F.; Amorim, F.G.;
Anjolette, F.A.P.; Cordeiro, F.A.; Wiezel, G.A.; Cerni, F.A.; Pinheiro-Junior, E.L.; et al.
Minor snake venom proteins: Structure, function and potential applications.
Biochim. Et Biophys. Acta (BBA)-Gen. Subj. 2017, 1861, 824–838.
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4. Damm, Maik, Benjamin-Florian Hempel, and Roderich D. Süssmuth. 2021. "Old World Vipers—A Review about Snake Venom Proteomics of Viperinae and Their Variations" Toxins 13, no. 6: 427. https://doi.org/10.3390/toxins13060427
5. Boldrini- França, J.; Cologna, C.T.; Pucca, M.B.; Bordon, K.D.C.F.; Amorim, F.G.;
Anjolette, F.A.P.; Cordeiro, F.A.; Wiezel, G.A.; Cerni, F.A.; Pinheiro-Junior, E.L.; et al.
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蛋白質(zhì)組學(xué)
抗體從頭測序
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