首例腸道“二代”免疫細胞浸潤的體內類器官的構建與驗證
類器官是由胚胎干細胞 (ESCs) 或誘導多能干細胞 (iPSCs) 衍生而來的體外 3D 細胞簇，與起源組織具有相似的組織學特征和功能。相比于傳統 2D 培養，類器官更具生理相關性，已被廣泛用于疾病研究和藥物開發。
盡管已有成熟的方法可以構建腫瘤、腸道、心臟和視網膜等多種類器官，但目前的類器官通常僅包含單一種類細胞，缺少體內微環境的復雜性。
例如，腫瘤類器官的培養中通常僅包含癌細胞，缺少腫瘤微環境 (TME) 細胞和腫瘤外部壓力 (如缺氧或免疫調節)，使得整個類器官復雜性大大降低，難以研究細胞外基質在驅動癌癥類器官表型和藥物敏感性中的機制[1][6]。而對于腸道類器官而言，亦是如此。在過去十年中，源自多能干細胞的人腸道類器官 (Human intestinal organoids, HIOs) 提高了我們對人腸道發育和疾病的認識，為研究人類腸道器官發生和生理學提供了有價值的模型，但它們缺乏完全重現人類腸道生物學和疾病復雜性所需的免疫成分，難以模擬人腸道生物學和疾病的復雜性。
圖 1. 腸道類器官及腸上皮邊界的免疫細胞概述[1]
A：腸道類器官培養缺乏腸上皮微環境的任何細胞成分。小鼠小腸類器官在體外自發產生兩個特化結構域：隱窩樣結構域 (The crypt-like domain) 和絨毛樣結構域 (The villus-like domain)。B：穩定狀態下在腸上皮邊界發現的常駐免疫細胞概述。腸上皮包含 αβ T 細胞受體 (TCR)+和 γδ TCR+上皮內淋巴細胞 (Intraepithelial lymphocytes, IELs)，而腸固有層包含不同亞群的樹突狀細胞、巨噬細胞、T 細胞、產生 IgA 的漿細胞和固有淋巴樣細胞 (Innate lymphoid cells, ILCs) 等等。
雖然類器官仍存在以上種種局限性，但別慌！科學家們已開啟了“二代”類器官的新時代！話不多說，快來跟著小 M 來看看首次構建的包含功能性免疫系統的體內類器官吧~
近期，Carine Bouffi 等人 在 Nature Biotechnology 上發表了題為“In vivo development of immune tissue in human intestinal organoids transplanted into humanized mice”的研究成果。
作者將人腸道類器官 (HIO) 移植到具有人源化免疫系統的小鼠 (NSGS) 的腎囊下，生成了含有免疫細胞的 HIO。進一步研究發現人類免疫細胞可暫時遷移到粘膜并形成類似于人類腸道淋巴濾泡的細胞聚集體。此外，接觸微生物后，上皮微褶皺細胞 (Microfold cells，M cell) 數量增加，導致 HIO 腔中 IgA 抗體的分泌并決定免疫細胞活化[7]。該文成功開發出“二代”腸道類器官(Next-generation HIO system)，下面，且聽小 M 來為大家細細解讀~
▐ 模型構建
實驗工作流程如下圖所示：
圖 2. 人源化小鼠模型驗證述[7]。
將體外 HIO 移植到人源化 (NSGS) 小鼠體內，移植后第 12、16 和 20 周，收集 HIO 和目標組織進行分析 。注: NSGS 小鼠: NOD/Scid Il2rg null Tg (hIL3、hGM-CSF 和 hSCF) 小鼠。
1. HIO 構建
a) 培養人 H1 胚胎干細胞：在 mTESR1 培養基中無飼養層條件下培養 WA-01 細胞。
b) 誘導確定的內胚層：用 Accutase 分離細胞，以每孔 7-10 萬 個的細胞密度鋪板于基質膠包被的 24 孔板中。達到 80-95% 融合度時，用 100 ng/mL Activin A 處理 3 天。
c) 誘導中后腸球狀體形成：用含 500 ng/mL FGF4 和 3 μM CHIR-99021 的后腸誘導培養基處理內胚層 4 天。
d) HIO 生成：將球體鋪在基質膠中，用含 100 ng/mL EGF 的腸道生長培養基中持續培養，至產生 HIO。
2. HIO 移植a) 將體外成熟 28 天的單個 HIO 從基質膠中取出，移植到人源化小鼠腎囊下 (具體手術方法可參考原文獻)。
b) 在術后 48 h 內進行監測，第 12 周和第 16 周對小鼠實施安樂死，收集組織并分析。▐ 類器官中腸細胞譜系驗證
作者對移植的 HIO 進行了腸道細胞細胞標志物染色，發現在 NSGS 小鼠中移植和分化的人腸道類器官中存在所有主要的腸道細胞譜系，證明了 HIO 的成功構建和移植。
圖 3. HIO 移植到人源化小鼠體內的腸細胞譜系表達[7]。
HIO 移植后 12、16 和 20 周時，HIO 切片上的腸道標志物 (紅色)、人 CD45 (綠色) 和人 CDH1 (白色) 在 (A) 腸上皮細胞標志物 VIL/Villin、(B) 杯狀細胞標志物 MUC2/Mucin2、(C) 潘氏細胞標志物 LYZ/Lysozyme 和 (D) 腸內分泌細胞標志物 CHGA/Chromogranin A) 的共染色。
▐ 移植的 HIO 存在免疫細胞浸潤
隨后，作者通過免疫組化 (IHC) 證明了移植的 HIO 固有層和上皮存在人免疫細胞 (hCD45+ 細胞) 浸潤 (圖 4A)，并形成與人類胎兒 (圖 4B) 或成人腸道免疫類似的細胞聚集體 (圖 4C)，說明移植的 HIO 中存在免疫細胞浸潤和結構。
圖 4. 使用免疫系統人源化小鼠模型將免疫細胞整合到 HIO 中[7]。
A：移植 HIO 后不同時間點用抗-人 CD45 抗體對 HIO 進行 IHC 染色; B: 用抗-人CDH1 抗體 (藍色)、抗-人 CD45 抗體 (綠色) 和 DAPI (白色) 對人胎兒腸道進行免疫熒光染色; C: 用抗-人 CD45抗體對成人空腸進行 IHC 染色。
▐ 類器官中免疫構成與人胚胎腸道發育類似
作者還進一步通過質譜流式細胞術 (一種將流式細胞技術與質譜分析技術結合在一起的新技術，用于高緯度和高通量單細胞分析）和免疫組化證實 HIO 中存在 GALT 相關 B 細胞和 T 細胞 （參見原文 Fig 2, 3)。此外，作者還發現移植 HIO 中淋巴樣結構的時空發育與胎兒腸道中發育的淋巴濾泡相似，具體表現在 T 細胞/B 細胞聚集 (圖 5A)、分區 (圖 5B)，粒細胞/漿細胞浸潤等等 (圖 5C-E)。
圖 5. 移植的 HIO 中的淋巴樣結構與胎兒腸道中的淋巴發育相關性比較[7]。
A-C: HIO 切片用抗人-CD3 抗體標記 T 細胞 (上)，用抗人-CD4 /CD8 抗體標記 T 輔助細胞/細胞毒性 T 細胞 (中)，用抗人-CD20 抗體標記 B 細胞 (下)。D: H&E 染色顯示發育后期 HIO 中的中性粒細胞。E: H&E 染色顯示漿細胞，并進行 IHC 染色確認。
▐ 病原體侵染后的免疫應答
最后，作者將移植的 HIO 暴露于病原體 (E.coli )，通過檢測 M 細胞標志物 GP2，證明了 M 細胞的存在，且與免疫細胞重合 (圖 6A-D)，并發現 HIO 的粘液中存在高水平 IgA 抗體 (圖 6E)，且 M 細胞和 B 細胞共定位良好 (圖 6F)。由此證明 M 細胞具有轉運抗原以激活免疫細胞的功能，以及腸道上皮細胞-免疫細胞存在 Cross-talk，即 HIO 上皮和免疫細胞之間的串擾誘導淋巴樣結構的形成以及 M 細胞的分化和功能。
圖 6. 移植的 HIO 暴露于病原體 (E.coli)后可誘導 M 細胞產生[7]。
A-C: HIO 切片用抗人-CD45 抗體, 抗人-GP2 抗體, 抗人-MUM1 抗體分別標記免疫細胞, M 細胞和漿細胞。D: GP2 基因表達變化。E: HIO 粘液中的人 IgA 水平變化。F:使用抗人-CDH1、抗人-GP2 和抗人-CD20 進行免疫熒光染色。
本期小 M 為大家介紹了首例腸道“二代”類器官的構建與驗證。該研究一定程度上彌補了免疫相關研究的缺陷，為研究腸道發育、相關疾病和藥物發現的研究提供了更切實際的的模型。小 M 也相信這項研究也將為其他類器官領域的科學家們和同學們提供新思路~
| 基質膠 標準型/低生長因子型，有/無酚紅基底膜基質膠，用于干細胞/類器官培養。 |
| Activin A 多功能細胞因子，可誘導干細胞分化。 |
| FGF4 常見類器官培養因子，在早期發育中對中胚層誘導、神經發育等有重要作用。 |
| EGF 上皮組織生長因子，類器官培養因子。 |
| CHIR-99021 GSK-3 α/β 抑制劑，誘導干細胞分化，可用于類器官培養。 |
| DAPI DNA 熒光染料，活細胞/固定細胞染色。 |
| 抗-人 CD45 抗體 反應物種：人；可用于 WB、IHC-P、FC 實驗 |
| 抗-人 CD4 抗體 反應物種：人；可用于 WB、ICC/IF、IHC-P 實驗 |
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參考文獻:
[1] Bar-Ephraim YE, Kretzschmar K, Hans Clevers. Organoids in immunological research. Nat. Rev. Immunol. 2020, 20(5): 279-293.
[2] Sato T, et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 2009 May 14;459(7244):262-5.
[4] Clevers H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 2016 Jun 16;165(7):1586-1597.
[5] Kretzschmar K,et al. Organoids: Modeling Development and the Stem Cell Niche in a Dish. Dev Cell. 2016 Sep 26;38(6):590-600.
[6] LeSavage, B.L., et al. Next-generation cancer organoids. Nat. Mater. 2022, 21, 143-159.
[7] Bouffi C, et al. In vivo development of immune tissue in human intestinal organoids transplanted into humanized mice. Nat Biotechnol. 2023, 41(6): 824-831.
