一、什么是基因編輯？

基因編輯是指通過基因編輯技術(shù)對生物體基因組特定目標進行修飾的過程，可以精確地定位到基因組的某一位點上，在該位點上可以進行特定DNA片段的插入、缺失、修改和替換，從而改變其遺傳信息和表現(xiàn)型特征，最終應用于人類疾病治療、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、基因功能研究等多個領(lǐng)域。

基因編輯技術(shù)主要分為基因敲除、基因插入、基因突變和基因重組等四種技術(shù)。其中，基因敲除技術(shù)是最常用的，它的原理是通過CRISPR/Cas9等基因切割工具，將某個基因的特定序列剪切掉，使其失去功能，從而達到改變物種特征的目的。基因插入技術(shù)則是將外源基因插入到特定位置，使其成為物種的一部分，從而改變物種的特征。基因突變技術(shù)是指通過基因編輯技術(shù)，引入一定的突變，使基因的功能發(fā)生改變，從而改變物種的特征。最后，基因重組技術(shù)則是通過對基因的重組，改變基因的結(jié)構(gòu)，從而達到改變物種特征的目的。

基因編輯技術(shù)發(fā)展迅速，其中CRISPR-Cas9技術(shù)是最常用的基因編輯工具之一，已經(jīng)在許多生物體中實現(xiàn)了基因編輯。這項技術(shù)的出現(xiàn)為許多遺傳性疾病的治療帶來了希望，同時也在農(nóng)業(yè)、生態(tài)學等領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的應用潛力。

 

二、基本步驟

基因編輯的過程通常包括以下步驟：

1. 選取目標基因：根據(jù)研究需求選擇特定的基因作為目標基因。

2. 設(shè)計基因編輯器：根據(jù)目標基因的特點，設(shè)計相應的基因編輯器，包括指導RNA和Cas9蛋白等。

3. 導入基因編輯器：將基因編輯器導入到生物體內(nèi)，使其能夠準確地找到目標基因。

4. 激活基因編輯器：在合適的時間和條件下，激活基因編輯器，使其能夠?qū)δ繕嘶�因進行修飾。

5. 檢測和驗證：對經(jīng)過基因編輯的生物體進行檢測和驗證，確認基因編輯是否成功，并評估其表型和遺傳變化。

 

三、基因編輯器是什么？

基因編輯器是指用于對生物體基因組進行修飾和改造的工具，其中最常見的是CRISPR-Cas9系統(tǒng)。

CRISPR-Cas9系統(tǒng)由兩部分組成：Cas9蛋白和指導RNA（sgRNA）。其中，Cas9蛋白是一種能夠切割DNA的酶，而指導RNA則能夠引導Cas9蛋白找到目標基因組序列并對其進行切割。通過設(shè)計特定的指導RNA，可以實現(xiàn)對目標基因組的定點修飾，包括插入、缺失、修改和替換等操作。

除了CRISPR-Cas9系統(tǒng)外，還有其他類型的基因編輯器，如ZFNs（鋅指核酸酶）和TALENs（轉(zhuǎn)錄激活子樣效應物核酸酶）等。這些基因編輯器也都是通過對目標基因組進行修飾，從而實現(xiàn)改變生物體遺傳信息和表現(xiàn)型特征的目的。

 

四、 基因編輯中的CRISPR技術(shù)是什么？

CRISPR技術(shù)是一種基因編輯技術(shù)，可以用來對生物體的基因進行精確的編輯。該技術(shù)的中文名是“基因剪刀”。

CRISPR-Cas9系統(tǒng)是由兩部分組成的：一個是向?qū)�RNA，它能夠精確地找到目標基因，另一個是Cas9蛋白，它就像一個精準的剪刀，能夠?qū)⒛繕嘶�因準確地剪切下來。

首先，向?qū)�RNA與Cas9蛋白結(jié)合，形成一個復合體。然后，這個復合體被引導到目標基因的位置。Cas9蛋白會與目標基因結(jié)合，并剪切下這段基因。

剪切下來的基因可以被科學家重新編輯，比如替換某個堿基對、插入新的基因序列或者刪除某個基因片段。一旦編輯完成，新的基因序列會被引導回原來的位置，并插入到原來的基因組中。

CRISPR-Cas9技術(shù)的優(yōu)點在于它的高精度和高效率。與之前的基因編輯技術(shù)相比，CRISPR-Cas9技術(shù)可以更準確地找到目標基因，并且可以更高效地編輯基因。

此外，CRISPR-Cas9技術(shù)也具有廣泛的應用前景。它不僅可以用于治療遺傳性疾病，還可以用于治療癌癥、神經(jīng)性疾病以及其它許多疾病。

 

五、 向?qū)�RNA有哪些？

1. sgRNA（單向?qū)�RNA）：sgRNA是CRISPR-Cas9基因編輯工具中的一種特殊類型的向?qū)�RNA。它通過將crRNA和tracrRNA融合為一條單一的RNA分子，提高效率和便于生產(chǎn)。sgRNA 5′端20 bp序列是與靶序列互補配對的序列，如果編輯某個靶位點，只需要改變這20 bp的序列就可以實現(xiàn)。

2. crRNA（向?qū)�RNA的靶向序列）：在CRISPR-Cas9系統(tǒng)中，crRNA主要負責提供與目標基因互補配對的序列。這個序列全長并不與Cas9蛋白結(jié)合，只有其中20nt的部分序列在Cas9蛋白剪切DNA時提供目標序列的信息。

3. tracrRNA（向?qū)�RNA的非特異性導向序列）：tracrRNA主要與Cas9蛋白結(jié)合并形成復合物，幫助Cas9蛋白尋找目標基因。其主要功能是提供一種"通用"的導向序列，與不同的crRNA配對，以實現(xiàn)對多種基因進行編輯。

此外，某些文獻中還提到了一種叫做Alt-R® CRISPR-Cas9系統(tǒng)的向?qū)�RNA類型。該系統(tǒng)使用的crRNA和tracrRNA序列模擬的是化膿性鏈球菌的序列，為了提高效率和便于生產(chǎn)，已經(jīng)對其長度進行了優(yōu)化。這種系統(tǒng)使用的sgRNA是通過人的RNA聚合酶Ⅲ啟動子U6起始表達的，這個啟動子起始轉(zhuǎn)錄的第一堿基必須是G。

 

六、 CRISPR-Cas9的實驗流程有哪些？

1. 設(shè)計sgRNA：首先需要確定要編輯的目標基因序列，并設(shè)計針對該序列的特異性sgRNA（單向?qū)�RNA），該sgRNA與Cas9蛋白結(jié)合，引導其到目標基因的特定位置進行剪切。（像我們這邊，您可以提供要編輯的目的基因序列，會有對應的合成好的sgRNA挑選）

2. 構(gòu)建sgRNA-Cas9載體：將sgRNA和Cas9蛋白一起嵌入到一個可自我復制的病毒載體中，以便將sgRNA-Cas9復合物轉(zhuǎn)入到目標細胞中。

3. 構(gòu)建sgRNA-Cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)株：通過將sgRNA-Cas9載體轉(zhuǎn)染至目標細胞，并經(jīng)過多輪篩選和擴增，得到穩(wěn)定表達sgRNA-Cas9的細胞株，即sgRNA-Cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)株。
（針對這一步。我們有對應的轉(zhuǎn)染試劑供您挑選）

4. 篩選細胞克隆并進行qPCR驗證：在sgRNA-Cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)株中篩選出基因敲除成功的細胞克隆，通過qPCR（定量PCR）技術(shù)對這些細胞進行基因表達水平檢測，以驗證基因敲除成功。

5. 陽性克隆測序，選擇敲除純合細胞株：對陽性克隆進行全基因組測序，精確檢測基因敲除的位置和大小，并挑選敲除純合細胞株進行下一步實驗。

6. 篩選細胞單克隆測序：在敲除純合細胞株中篩選單克隆細胞，并進行全基因組測序，以確保基因敲除的準確性和一致性。

除了以上流程，實驗流程可能還包含其他內(nèi)容，比如在轉(zhuǎn)染過程中對細胞進行觀察和記錄等。具體的實驗流程可能會根據(jù)實驗的目的、條件和要求而有所不同。

 

七、 基因編輯之CRISPR-Cas9技術(shù)試劑推薦

1. Dharmacon CRISPR Cas9——無需克隆，任性編輯

① Edit-R Cas9核酸酶，基因編輯成功的關(guān)鍵
高效的基因編輯需要Cas9核酸酶有效的表達，為了滿足不同實驗目的和實驗方法，盡可能適應不同的實驗體系，Dharmacon設(shè)計不同的Cas9核酸酶表達質(zhì)粒、Cas9核酸酶mRNA和Cas9核酸酶蛋白，滿足不同實驗對象和實驗環(huán)境對啟動子活性、篩選標記和實驗手段的要求，保障實驗的成功率，降低實驗工作量。

1）Cas9 nuclease mRNA
☆ DNA-free系統(tǒng)消除了將不需要的外源DNA整合到宿主細胞基因組的可能性
☆ 熒光標簽Cas9 mRNA（mKate2或EGFP）可富集基因編輯細胞群
☆ 瞬時表達Cas9核酸酶可減少脫靶，獲得更可靠的實驗結(jié)果
☆ Cas9啟動子與細胞系間沒有不兼容的問題
☆ 使用DharmaFECT Duo轉(zhuǎn)染試劑輕松共轉(zhuǎn)染Edit-R sgRNA和Cas9 mRNA，或電轉(zhuǎn)染入難轉(zhuǎn)染的細胞 

 

圖注：三種細胞系中Cas9核酸酶mRNA的基因編輯

 

2）Cas9 nuclease protein NLS
純化的Cas9核酸酶NLS蛋白提供了一種隨時可用的選擇，使研究人員能夠以完全無DNA的方式加速基因編輯實驗

☆ 直接與sgRNA進行共轉(zhuǎn)染或共電轉(zhuǎn)
☆ 沒有添加外源DNA到系統(tǒng)中，有效防止質(zhì)粒DNA進入宿主細胞基因組的可能性   
☆ 啟動子與細胞系間沒有不兼容的問題
☆ 瞬時表達Cas9核酸酶以減少脫靶  

 

圖注：Cas9 protein RNP nucleofection

 

② Edit-R predesigned All-in-one lentiviral sgRNA
☆ 將sgRNA和Cas9核酸酶表達結(jié)合成單個載體，簡化遞送  
☆ 提供嘌呤霉素耐藥性和熒光分選標記，可以選擇成功整合載體的細胞
☆ 算法優(yōu)化保證功能蛋白敲除最大化及脫靶編輯最小化 
☆ 提供甘油菌質(zhì)粒形式和高滴度純化病毒顆粒形式產(chǎn)品  
☆ 最常用于難轉(zhuǎn)染細胞類型的敲除，或用于混合慢病毒sgRNA文庫篩選后的后續(xù)敲除。  
☆ 建議將EGFP選擇標記用于編輯細胞的快速富集，一旦熒光表達，就可以進行FACS分析。適用于壽命較短的細胞類型，如原代細胞

 

圖注：Edit-R All-in-one慢病毒sgRNA載體示意圖

 

2. 其余試劑推薦

貨號	品名	規(guī)格	產(chǎn)品介紹
jetPRIME	101000046	1.5mL	• 通用型DNA/siRNA 轉(zhuǎn)染試劑 • 卓越的轉(zhuǎn)染效率：可用于不同來源的貼壁細胞 • 更好的細胞活率：極其溫和的轉(zhuǎn)染模式 • 性價比高：更少的DNA和轉(zhuǎn)染試劑使用量 • 操作步驟簡單：血清，抗生素兼容
TransIT-X2® Dynamic Delivery system	MIR6000	1.5mL	• 高效——卓越的廣譜轉(zhuǎn)染 • 多功能——質(zhì)粒 DNA、siRNA/miRNA 或核糖核蛋白 (RNP) 復合物的遞送利刃 • 技術(shù)——新型非脂質(zhì)體聚合物遞送
DNeasy Blood & Tissue Kit (50)	69504	50T	從新鮮或冷凍的動物組織和細胞、血液、細菌中提取基因組DNA
QIAamp DNA Mini Kit (50)	51304	50T	從細胞、組織中提取DNA
UCP HiFidelity PCR Kit（100）	202742	100T	高保真PCR Mix
2× Xerox PCR Master Mix	abs60034	1mL	高保真PCR Mix
DNA凝膠/PCR純化試劑盒	abs60098	50次	膠回收試劑盒
QIAquick Gel Extraction Kit (50)	28704	50T	用于從酶反應中純化回收DNA或者用于膠回收，適用于DNA片段70bp-10kb
T7 Endonuclease I	P7062-1250U	1250U	用于識別錯配DNA、四方向交叉DNA或分支DNA等

 

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#2：CRISPR基因編輯大招∣安捷倫定制化學合成sgRNA
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#3：分子技術(shù)#6：轉(zhuǎn)染詳解：概念、分類、應用、步驟、細胞類型與常用試劑一網(wǎng)打盡