上期的蛋白組學FAQ文章推出后老師們積極關注，那么這期再給各位老師整理些經常咨詢的問題，以供參考。

Q&A
Q1 : 蛋白組一般是建議做多少個生物學重復？
A: 原則上是生物學重復越多越好，排除個體差異，篩選的差異蛋白更準確，驗證成功率更高。考慮到經費、統計分析需要及后續編輯可能會質疑的情況，臨床樣本建議每組十個重復以上，其他來源樣本每組至少三個重復。

Q2 : 蛋白組樣本如何寄送？
A: 常規組織、細胞、體液等生物樣本需要低溫保存，干冰寄送。膠條樣本可以冰袋寄送。

Q3 :蛋白組學能否測未知的蛋白？或者是表達的外源蛋白，該樣本物種數據庫里沒有的蛋白能否測到？
A:蛋白組學檢測結果是與已知的數據庫蛋白進行比對，無法預測未知的蛋白，如果需要檢測未知蛋白，可采用測序等其他方法。如果數據庫里不包含關注的蛋白，那么無法比對到。可以將關注的蛋白序列加入到數據庫里作為搜庫文件進行分析。

Q4 :磷酸化蛋白組學實驗的流程？
A:磷酸化蛋白組可以做非標記產品，也可以做標記產品。目前標記產品做的較多，可以增加檢測深度。實驗流程主要是包括樣本前處理、蛋白的提取、蛋白濃度的測定和跑膠質控、酶解成肽段、修飾肽段的富集、（肽段標記）、質譜檢測。方案多樣化，可以進行選擇，可以先富集再分級再檢測，或者先標記、分級、每級富集等等。

Q5 :蛋白檢測結果較少是為什么呢？
A:首先可能是數據庫比較小的原因，導致檢測到的結果比較少。可以選擇擴大層級或者選擇研究較多的近緣物種、模式物種數據庫進行搜庫分析。其次看下膠圖，判斷樣本本身條帶是否較少，是否存在高豐度蛋白，高豐度蛋白的存在會影響檢測數量。

Q6 : 鑒定到的蛋白與凝膠電泳圖譜中估測分子量差異很大的原因？或者為什么SDS-PAGE膠上不同位置條帶的質譜鑒定結果中含有同一個蛋白？
A: 由于體內或者體外因素，導致同一蛋白存在不同形式的修飾、剪切或者降解，從而形成凝膠電泳圖中能夠看到的存在差異分子量的蛋白條帶。然而這些蛋白在質譜鑒定時會同時指向數據庫中同一個、全長的、無修飾的蛋白理論序列。因此會出現凝膠電泳圖中的蛋白分子量（實際分子量）與鑒定的蛋白分子量（理論分子量）不同的情況。

Q7 : 差異蛋白如何篩選？
A: 差異蛋白篩選的條件主要是結合T檢驗的p值和FC值，一般標記產品按照FC>1.2 or FC<0.83,p<0.05;非標記產品按照FC>1.5 or FC<0.67,p<0.05進行篩選。實際過程中也會結合檢測結果進行放寬或者卡嚴，一般控制在檢測結果20%以內，5-10%為佳。

Q8 : 做完蛋白組學，選用何種方法驗證呢？
A: 常規蛋白驗證方法主要包括WB、ELISA、PRM。如果關注的蛋白數量不多且有對應的商品化檢測試劑盒或者抗體，建議選擇ELISA或WB方法進行驗證，此方法更為成熟。如果關注的蛋白數量較多，也沒有商品化的抗體，建議選用PRM的方法。經費充裕的情況下，抗體制備也是一個不錯的選擇。

Q9 : 通過western blot檢測到的蛋白，為什么質譜沒有檢測到或者只檢測到一個肽段？
A: Western blot 檢測是將目的蛋白信號放大很多級之后進行檢測的，靈敏度很高，（除非特異性結合之外）幾乎不受復雜樣品中背景蛋白豐度的影響。質譜檢測時樣品中豐度較高的蛋白優先、多次被檢測到，而豐度較低的蛋白則因為肽段信號過弱被淹沒而不能被檢測到。因此，如果樣品中待檢測的目標蛋白豐度較低，即使WB能夠檢測到，質譜并不一定能檢測到或者僅能檢測到較少的肽段數。

Q10 : 同一批樣本，轉錄組數據下調，但是蛋白組學結果上調，這種是什么情況？
A: 這是正常的現象，上下游不是一一對應的關系，常規mRNA與蛋白質間的相關系數僅為0.4~0.5。一個蛋白的表達受到很多因素的控制，除了這個蛋白對應的mRNA之外，還有比如轉錄因子，增強子，抑制子，DNA和RNA的修飾作用等等。

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