基因編輯（gene editing），又稱基因組編輯（genome editing）或基因組工程（genome engineering），是一種新興的比較精確的能對生物體基因組特定目標(biāo)基因進(jìn)行修飾的一種基因工程技術(shù)�；�因編輯技術(shù)指能夠讓人類對目標(biāo)基因進(jìn)行定點(diǎn)“編輯”，實(shí)現(xiàn)對特定DNA片段的修飾。
 

目前廣泛使用的基因編輯技術(shù)是CRISPR-Cas9，它是細(xì)菌和古細(xì)菌在長期演化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。而CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，則是對靶向基因進(jìn)行特定DNA修飾的技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)也是用于基因編輯中前沿的方法。該技術(shù)在一系列基因治療的應(yīng)用領(lǐng)域都展現(xiàn)出極大的應(yīng)用前景，但過大的蛋白分子成為CRISPR未來應(yīng)用方式中最重要的瓶頸之一。

最近，來自美國加利福尼亞大學(xué)伯克利分校創(chuàng)新基因組學(xué)研究所的研究人員發(fā)現(xiàn)了一種新型基因編輯工具——CasΦ，它是一種功能最小的CRISPR-Cas系統(tǒng)，由1〜70 KD的CasΦ蛋白和一個(gè)CRISPR陣列組成，且僅在巨型噬菌體的基因組中編碼，其體積是CRISPR-Cas 9的一半，這項(xiàng)研究成果于7月16日發(fā)表在《Science》雜志上。
 

DOI: 10.1126/science.abb1400
本研究中，CasΦ（Cas12j）是巨型噬菌體分枝中編碼的Cas蛋白家族，巨型噬菌體用它來誘使細(xì)菌抵抗自身而不是自身的病毒。它使用單個(gè)活性位點(diǎn)進(jìn)行CRISPR RNA（crRNA）加工和crRNA指導(dǎo)的DNA切割，以靶向外來核酸。從進(jìn)化關(guān)系而言，CasΦ或許更為“古老”，其與V型CRISPR-Cas蛋白的同源性不足7%，但與V型CRISPR-Cas蛋白的源頭TnpB核酸酶超家族的部分蛋白有更高同源性。研究發(fā)現(xiàn)，CasΦ借助于單一向?qū)�RNA的引導(dǎo)，并依賴于PAM位點(diǎn)的指引以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)DNA的識別（其中CasΦ-2所識別的PAM序列為5’-TBN-3’（B=G,T,C））。
 

研究人員在論文中還研究了來自宏基因組的三個(gè)不同的CasΦ直系同源物：CasΦ-1，CasΦ-2和CasΦ-3。為了檢驗(yàn)CasΦ在細(xì)菌細(xì)胞中識別和靶向DNA 的能力，他們測試了CasΦ 是否可以保護(hù)大腸桿菌免于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。他們首先試圖確認(rèn)核酸酶是否像其他Cas核酸酶一樣使用前間區(qū)序列鄰近基序（PAM）來靶向DNA序列，因此他們轉(zhuǎn)化了一個(gè)包含crRNA互補(bǔ)靶位點(diǎn)附近隨機(jī)區(qū)域的質(zhì)粒文庫，從而減少含有功能性PAM的質(zhì)粒。這揭示了CasΦ具有靶向crRNA引導(dǎo)的雙鏈DNA（dsDNA）的能力。
 

隨后，研究人員使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和質(zhì)粒干擾試驗(yàn)確定了CRISPR- CasΦ系統(tǒng)運(yùn)行所需的組件。他們觀察到casΦ基因的轉(zhuǎn)錄和減少的CRISPR陣列，但沒有證據(jù)表明其他非編碼RNA，例如基因座內(nèi)的反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）。此外，CasΦ活性可以通過改變引導(dǎo)RNA來重新編程為靶向其他質(zhì)粒序列，這表明其天然環(huán)境中的核酸酶是一種功能性噬菌體蛋白，以及能夠切割crRNA互補(bǔ)DNA的CRISPR-Cas效應(yīng)子。數(shù)據(jù)還表明，該單一RNA系統(tǒng)比其他活性CRISPR-CAS系統(tǒng)更加緊湊。
 

接下來，研究小組需要了解CasΦ在體外對DNA的識別和裂解要求。結(jié)果表明，CasΦ的裂解活性僅在識別順式DNA時(shí)才能觀察到，而且只需要最低的PAM條件，這可能有利于更廣泛的核酸檢測。
最后，為了研究CasΦ是否能用于人類基因組編輯，研究人員在HEK293細(xì)胞中使用了與crRNA共表達(dá)的CasΦ進(jìn)行了基因破壞測定。他們發(fā)現(xiàn)，CasΦ-2和CasΦ-3誘導(dǎo)了基因組整合增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）基因的定向破壞。其中，具有單個(gè)指導(dǎo)RNA的CasΦ-2能夠編輯多達(dá)33％的細(xì)胞，這與先前報(bào)道的CRISPR-Cas9，CRISPR-Cas12a和CRISPR-CasX的水平相當(dāng)。
 

巨噬細(xì)胞編碼的CasΦ在其宿主的超感染情況下的功能示意圖
 

總結(jié)：CasΦ的小尺寸及其最小的PAM需求將特別有利于基于載體的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，以及更廣泛的可靶向基因組序列。此外，其緊湊的特質(zhì)使其特別適合工程和實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化，可創(chuàng)造用于基因組操作的新功能。當(dāng)考慮核酸酶在臨床上未來的潛力時(shí)，Al-Shayed補(bǔ)充說，由于它來自環(huán)境噬菌體，而不是致病菌或人類腸道細(xì)菌，這可能使其成為更好的治療工具。 但其進(jìn)一步功能和可能的應(yīng)用方面仍有許多工作要做。例如，其脫靶效應(yīng)的潛力尚未得到測試。重要的是，這項(xiàng)研究展示了噬菌體來源的Cas系統(tǒng)的潛力，并且表明CRISPR更廣泛的生物學(xué)機(jī)制仍然未知。
 

參考：Pausch Patrick,Al-Shayeb Basem,Bisom-Rapp Ezra et al. CRISPR-CasΦ from huge phages is a hypercompact genome editor.[J] .Science, 2020, 369: 333-337.