免疫原的設計策略
前言
抗體（antibody）是指機體由于抗原的刺激而產(chǎn)生的具有保護作用的蛋白質，是由漿細胞分泌并參與體液免疫的重要分子。眾所周知，抗體被廣泛用于基礎科學研究、病理診斷、檢測試劑盒和藥物的研發(fā)。
針對不同應用的抗體來設計不同的抗原是抗體開發(fā)的關鍵第一步。抗原，是指能夠刺激機體產(chǎn)生（特異性）免疫應答，并能與免疫應答產(chǎn)物抗體和致敏淋巴細胞在體外結合，發(fā)生免疫效應（特異性反應）的物質。
為研發(fā)生產(chǎn)最優(yōu)質的抗體，華安生物的小伙伴在免疫原設計上經(jīng)過無數(shù)次的摸索，積累了多年經(jīng)驗。今天，小編就將免疫原設計策略分享給大家~
常用的免疫原有很多種，如多肽、蛋白、小分子、核酸、糖類及細胞等，但如今最常見的免疫原還是以多肽和蛋白為主。
根據(jù)抗體的應用不同，我們對免疫原的設計策略也有所不同。
該類抗體的免疫原一般設計為多肽或制備蛋白的片段。目前有不同網(wǎng)站可以用于參考設計多肽，該免疫原設計需考慮多肽親水性、免疫反應性及種屬特異性這三點。如http://tools.iedb.org/main/,該網(wǎng)站列出了B細胞表位，T細胞表位的預測。
通過比對不同種屬的蛋白序列來比較種屬特異性，以便測試設計的多肽在不同種屬中的差異。
圖2：HSP27人蛋白，小鼠蛋白和大鼠蛋白的序列比對
通過序列比對圖，我們可以根據(jù)最終的抗體要求，進行序列設計。若需要抗體能同時識別不同種屬，設計時則優(yōu)先考慮序列一致的區(qū)域；若只需要抗體能特異性識別人蛋白或是小鼠蛋白，設計時就需要找出特異性的片段。圖中*表示氨基酸在不同種屬中是一致的。
圖3：蛋白的三位結構，該蛋白的三維結構，有折疊區(qū)，也有線性區(qū)域
蛋白三維結構在多肽設計考慮中也是至關重要的。常見的B細胞抗原表位一般會選擇線性區(qū)域，而非折疊區(qū)域或螺旋區(qū)域。但T細胞抗原表位設計則需考慮蛋白的空間構象，將目的區(qū)域的關鍵氨基酸設計成多肽。
Tips
通過不同的軟件或是預測網(wǎng)站進行多肽設計后，根據(jù)研究目的，確定所研發(fā)的抗體需要特異性識別該蛋白，或是能識別該蛋白的同源蛋白，進行序列blast。根據(jù)blast的結果，預先判斷所設計的多肽的同源性。
PART02 應用于針對修飾性位點的抗體研發(fā)
蛋白質的翻譯后修飾對生命活動有著重要作用，如磷酸化，乙酰化，甲基化等。針對該類抗體研發(fā)，設計免疫原的策略主要是設計相應的修飾位點多肽。
首先找到修飾位點，如磷酸化，根據(jù)磷酸化位點附近的氨基酸序列，設計15-20個氨基酸的多肽，應用軟件或網(wǎng)站預測該磷酸化位點附近的多肽的免疫反應性，挑選反應性最高的序列作為免疫原，并進行種屬特異性的檢查和非同源蛋白的比對。在合成含修飾位點的多肽的同時，也需要合成該位點無修飾的多肽用于交叉檢測，最終獲取針對特異性位點的抗體。
Tips
根據(jù)研究目的的不同，有時需要抗體既可識別修飾后的蛋白，又可識別無修飾的蛋白，即pan抗體。針對這類抗體，篩選時需要能識別兩種多肽。
PART03 應用于試劑盒配對用抗體
試劑盒配對用抗體通過識別蛋白不同表位來檢測樣品中目的蛋白的含量。因此設計此類免疫原應先調研該蛋白的整體結構、整個蛋白的大小以及是否含有剪切片段；進而根據(jù)調研的信息設計蛋白片段。或制備全長蛋白，或制備蛋白片段。抗體篩選根據(jù)陽性抗體進行表位預測，針對不同表位的抗體進行配對檢測，最終獲取需要的抗體對用于試劑盒后期的研發(fā)。
圖4：針對M1102項目蛋白免疫并獲取的單克隆抗體
該實驗用6B9作為競爭抗體。實驗結果顯示：克隆A5A7與A4A8的結合位點與6B9不同；克隆A3F5的結合位點與6B9類似；克隆A4A7的結合位點與6B9有部分相似。因此我們在進行配對實驗的時候，可以優(yōu)先挑選結合位點不同的抗體進行配對，如6B9-A4A8, A4A7-A4A8等。
PART04 應用于抗體藥物的研發(fā)
抗體藥物的研發(fā)指針對不同的藥物靶標，進行大量的抗體藥物前提的研發(fā)。
用于藥物研發(fā)的抗體，免疫原設計要求更為嚴格，目前免疫階段采用真核表達的蛋白。抗體藥物靶標主要分為兩類，分泌型靶標（VEGF, IL-6, IL-17等）和跨膜蛋白（PD-1， BCMA, EGFR等）。
分泌型靶標，一般直接制備真核表達的蛋白用于免疫。蛋白制備后對所表達的蛋白進行功能性實驗的檢測、細胞的增殖作用以及與相應配體的結合實驗等，以確保所制備的免疫原是有活性的蛋白。
跨膜蛋白，所制備蛋白的策略會有不同，如下圖所示。
上圖蛋白為I型膜蛋白，胞外區(qū)為蛋白的結合區(qū)，胞內為蛋白的活性區(qū)域。在設計免疫原的時候，有兩個策略。一是設計胞外的結合區(qū)，制備蛋白；二是用過表達該蛋白的細胞作為免疫原。設計免疫原后，利用相應的需要設計檢測的蛋白進行抗體的篩選。有時蛋白的胞外區(qū)會有不同的結構域，如IgC結構域，α亞基，β亞基等（圖4），針對此類蛋白，根據(jù)文獻，可以找出最重要的結合結構域制備蛋白。最佳策略是制備胞外區(qū)的片段以及含特殊結構的蛋白用于免疫，效果更佳。
Tips
利用過表達細胞進行免疫，可以使蛋白以天然狀態(tài)展示在細胞表面，并結合蛋白篩選和細胞篩選，這樣得到的抗體，其結合活性更佳。
PART05 其他特殊的抗體
對于不同研究目的需制備不同的抗體。如針對特殊結合位點的抗體研發(fā)。
圖7：某蛋白與小分子的結合示意圖。
小分子與該蛋白的結合位點為一邊是折疊區(qū)尾部結構，一邊是線性區(qū)域，而且該小分子與蛋白的其他部分無接觸。因此，設計免疫原主要以線性表位為主，同時根據(jù)折疊區(qū)和線性表位的距離，設計T細胞表位的多肽。
同時，有些蛋白有原始形態(tài)和剪切體，針對這類抗體設計免疫原，需根據(jù)最終需要檢測的目的片段進行設計，可以設計同時識別剪切體和全長，也可設計只識別全長，這類抗體有時可以用于檢測血清的游離分子的殘存。
總結
綜上所述，制備免疫原的方法較多，但根據(jù)抗體的最終用途，免疫原的設計策略各有不同。如何能做到事半功倍，前期需要對靶標有充分的認識，選擇合理的片段進行制備，才能得到我們所需的抗體。
以上就是華安生物進行免疫原設計的一些淺顯經(jīng)驗，希望能給正在研究的小伙伴們帶來幫助，有需要的童鞋記得收藏哦~
文章中部分圖片來自網(wǎng)絡
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杭州華安生物技術有限公司成立于2007年3月，總部位于中國杭州，是一家從事抗體研發(fā)與生產(chǎn)的國家高新技術企業(yè)。公司致力于為全球的科研工作者和工業(yè)客戶提供高品質的抗體試劑及抗體定制服務，生產(chǎn)體系通過ISO9001國際質量體系認證。公司的產(chǎn)品線包括兔單抗、小鼠單抗、兔多抗、羊駝抗體、二抗、蛋白/多肽、抗體檢測用相關試劑等11000余種。2015年，公司開始專注于高通量重組兔單克隆抗體的研發(fā)與產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。同時，公司也為客戶提供定制抗體的開發(fā)、純化和篩選服務。
迄今為止，公司已為各個領域完成 3000個定制科研抗體項目，為工業(yè)級客戶開發(fā)IVD診斷用腫瘤標志物系列抗體原料和食品安全檢測相關抗體百余種，為制藥公司提供包括PD1和PD-L1熱門靶點在內的早期抗體藥物篩選十余種。
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