雖然通過預(yù)測的方法能夠快速篩選出大量潛在靶點(diǎn)，但精準(zhǔn)度相對(duì)不高，而且通常無法定位到某種細(xì)胞或組織中。由于靶點(diǎn)可能在不同的細(xì)胞中表達(dá)水平不同或發(fā)揮不同的作用，這種缺乏細(xì)胞特異性的預(yù)測可能會(huì)導(dǎo)致在實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證階段的失敗。

實(shí)驗(yàn)找靶則是通過具體的生物實(shí)驗(yàn)來篩選靶點(diǎn)，其底層邏輯一般是通過各種實(shí)驗(yàn)方法找到細(xì)胞或組織中能夠與藥物結(jié)合的潛在蛋白，而后通過結(jié)合層面和功能層面的雙重驗(yàn)證來確認(rèn)靶點(diǎn)在疾病中的作用以及藥物可以通過調(diào)節(jié)該靶點(diǎn)功能從而發(fā)揮藥效。這不僅能夠提高靶點(diǎn)篩選的準(zhǔn)確性，也為靶點(diǎn)選擇提供了更豐富的生物學(xué)背景，使得藥物研發(fā)更具針對(duì)性和有效性。

實(shí)驗(yàn)找靶常用的方法主要有 DARTS、SPR 和 Pulldown 技術(shù)等，且看小 M 為大家逐一介紹~

Section.02
DARTS 找靶技術(shù)

藥物親和反應(yīng)靶點(diǎn)穩(wěn)定性（Drug affinity responsive target stability, DARTS）的概念最初由 Brett Lomenick 等人于 2009 年提出，其基本原理是靶蛋白與小分子配體結(jié)合后穩(wěn)定性增加，可以增強(qiáng)靶蛋白對(duì)蛋白酶酶解作用的抗性，以此來進(jìn)行靶蛋白篩選，同時(shí)無需對(duì)小分子進(jìn)行修飾^[2]。

DARTS 找靶的一般實(shí)驗(yàn)流程：

1. 蛋白庫的制備 (通常為目標(biāo)細(xì)胞或組織的蛋白裂解液)；
2. 蛋白裂解液與小分子共孵育；
3. 蛋白酶水解 (合適的蛋白酶濃度至關(guān)重要)；
4. 通過考馬斯亮藍(lán)染色或銀染等方法檢測對(duì)照組和加藥組蛋白的差異；
5. 目標(biāo)蛋白凝膠條帶收集；
6. 通過質(zhì)譜等方法對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行鑒定。

圖 1. 利用 DARTS 技術(shù)找靶的流程。

文獻(xiàn)案例

作者通過表型篩選及驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)藥物 desloratadine 在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中都能夠顯著抑制肝細(xì)胞癌 (HCC) 的生長和增殖。為了探究 desloratadine 發(fā)揮抗癌生物活性的分子機(jī)制，作者通過 DARTS 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了 53 種潛在靶蛋白，并從中選擇了 5 種感興趣的蛋白質(zhì)修飾酶進(jìn)行進(jìn)一步研究。通過蛋白表達(dá)、Knockdown、細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵襲和遷移以及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)等驗(yàn)證了 desloratadine 通過靶向 NMT1 蛋白調(diào)節(jié) HCC 的發(fā)展，利用 SPR 技術(shù)驗(yàn)證了 desloratadine 和 NMT1 蛋白的結(jié)合，通過分子對(duì)接、蛋白點(diǎn)突變聯(lián)合 SPR 技術(shù)找到了 desloratadine 和 NMT1 蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。

圖 2. 利用 DARTS 技術(shù)發(fā)現(xiàn) desloratadine 通過靶向 NMT1 蛋白調(diào)節(jié) HCC 的發(fā)展^[3]。

Section.03
SPR 找靶技術(shù)

表面等離子共振 (Surface Plasmon Resonance, SPR) 是一種無標(biāo)記、實(shí)時(shí)檢測分子相互作用的技術(shù)。它基于表面等離子共振原理，實(shí)時(shí)監(jiān)測分子在固體表面 (通常是金屬表面) 上的結(jié)合與解離過程。

雖然 SPR 實(shí)驗(yàn)通常用來檢測兩個(gè)分子之間的相互作用，但是 SPR 的這一特性也使其可以用于從復(fù)雜樣品中“垂釣”與藥物相互作用的分子。

實(shí)驗(yàn)時(shí)，將藥物固定在芯片上，蛋白裂解液稀釋為不同濃度，采用多濃度上樣的方式，將不同濃度的裂解液與藥物互作，收集與小分子結(jié)合的蛋白并通過高分辨質(zhì)譜進(jìn)行鑒定，從而得到藥物的潛在靶蛋白。同時(shí)，SPR 技術(shù)也常用于靶蛋白與藥物的親和力驗(yàn)證。

圖 3. 利用 SPR 技術(shù)找靶的流程。

文獻(xiàn)案例

作者通過細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡等表型實(shí)驗(yàn)從 1,504 種 FDA 上市藥物中篩選并驗(yàn)證了 Lomitapide 對(duì)耐藥多發(fā)性骨髓瘤 (Multiple myeloma，MM) 細(xì)胞有很好的抗腫瘤活性，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí) lomitapide 可以抑制 MM 的疾病進(jìn)程。

為了確定 lomitapide 的潛在靶點(diǎn)，作者利用 SPR 結(jié)合 HPLC-MS 篩選得到 39 個(gè)可以與 lomitapide 結(jié)合的蛋白，并選擇了 MS 分析排名第 1 位的 PARP14 蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。通過 SPR 實(shí)驗(yàn)證實(shí) lomitapide 與 PARP14 蛋白能夠直接結(jié)合 (Kd = 101 nM)，并在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中利用 knockout 證實(shí) Lomitapide 通過靶向 PARP14 誘導(dǎo) MM 線粒體功能障礙和線粒體自噬，從而揭示了 Lomitapide 對(duì)抗 MM 的新機(jī)制。

 
Section.04
SPIDER 鄰近標(biāo)記
Pull Down 技術(shù)

特異性糖基化作為標(biāo)識(shí)報(bào)告物 (Specific Pupylation as IDEntity Reporter, SPIDER) 是一種基于底物的鄰近標(biāo)記活性和鏈霉親和素 (SA)-生物素系統(tǒng)來識(shí)別蛋白質(zhì)-生物分子相互作用的方法。

當(dāng)靶蛋白 (Prey) 與帶有生物素標(biāo)記的誘餌分子 (Bait) 發(fā)生相互作用時(shí)，會(huì)同時(shí)與生物素偶聯(lián)上的 SAm-PupE 靠近，在 PafA 酶的催化作⽤下，PupE 的 C 末端會(huì)與 Prey 蛋白表面的賴氨酸殘基共價(jià)相連，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶蛋白的捕獲。該過程可以將生物分子與蛋白質(zhì)之間的非共價(jià)結(jié)合相互作用轉(zhuǎn)換為 SAm-PupE 與靶蛋白的共價(jià)連接，從而能夠穩(wěn)定地用于后續(xù)靶蛋白的富集、鑒定和分析。

圖 5. SPIDER 技術(shù)原理示意圖。

對(duì)于實(shí)驗(yàn)找靶而言，針對(duì)藥物特點(diǎn)選擇合適的實(shí)驗(yàn)方案尤為重要，一起來看看上述 3 種藥物找靶技術(shù)各自的應(yīng)用范圍吧！

表 2. 不同藥物找靶技術(shù)的特點(diǎn)及應(yīng)用范圍。

 
那么有的小伙伴可能會(huì)問了，找到潛在結(jié)合蛋白之后，要如何驗(yàn)證這些靶點(diǎn)是否是疾病的靶點(diǎn)呢？活性分子又是否是通過某個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮藥效的呢？別著急，后續(xù)的驗(yàn)證方法小 M 也為你總結(jié)好了，噔噔噔噔~

表 3. 實(shí)驗(yàn)找靶后續(xù)驗(yàn)證方法舉例。

 
看了小 M 的介紹，大家現(xiàn)在有沒有一些找靶的思路了呢？MCE 藥物找靶平臺(tái)提供多種找靶技術(shù)，結(jié)合經(jīng)驗(yàn)豐富的蛋白表達(dá)純化和分子互作研究平臺(tái)，可以為藥物潛在靶點(diǎn)的識(shí)別和驗(yàn)證提供全面和個(gè)性化的實(shí)驗(yàn)方案。歡迎來和小 M 一起探討~

[1] Isabella Gashaw, et al. What makes a good drug target?. Drug Discovery Today. 2012.S24-S30.
[2] Lomenick B, et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106(51):21984-21989.
[3] Tan, XP., et al. Blockade of NMT1 enzymatic activity inhibits N-myristoylation of VILIP3 protein and suppresses liver cancer progression. Sig Transduct Target Ther 8, 14 (2023).
[4] Honghao Zhang, et al.Targeting PARP14 with lomitapide suppresses drug resistance through the activation of DRP1-induced mitophagy in multiple myeloma. Cancer Letters.2024.