文章原創： 豬豬俠愛科學 文章來源：蛋白動態

AlphaFold (AF) 預測的很多蛋白結構已達到甚至有些超過實驗精度，但AF還遠遠不能取代實驗對所有蛋白質結構進行精準預測。常見的原因如下：
1. 有的天然無序蛋白在溶液中不存在單一的穩定的結構狀態，而AF預測其有結構(一般為結合底物后的結構)，出現“假陽性”結果，如突觸核蛋白(α-synuclein)；
2. AF無法預測點突變如與疾病相關的突變體以及翻譯后修飾對蛋白造成的結構擾動；
3. AF無法預測周圍環境因素如膜環境對蛋白可能造成的結構影響，因此不能準確預測一些膜蛋白的結構；
4. AF無法預測蛋白結合底物后的構象變化；
5. AF無法預測蛋白質在溶液中存在的不同構象；
6. AF預測的蛋白結構loop區域一般準確度較低；
7.最后一點是，即便pLDDT置信度值高于80，AF預測的結構與實驗的晶體結構仍然存在差異！
8. 其他的尚未發現的可能影響AF預測精度的因素...

本文介紹屬于8 (即不在常見的1-7類) 的一個案例，AF無法正確預測其結構但是給出了很高的置信度，這表明AF預測的結構并不是100%真實的，基于實驗的結構解析或者驗證仍必不可少！如下圖所示，AF2/3預測的蛋白結構與液體核磁解析的結構存在較大差異，其中最明顯的是N端 (1-36) 的兩個β片：


 

詳細的結構差異有以下幾點：
1.N端的pro-domain (1-36) 在AF結構中遠離蛋白核心區域而在液體核磁結構中則是作為其一部分，除此以外，β片的長度也不同，實驗結構的β片更長；
2. 除pro-domain外，其他蛋白折疊區域 (βAF和αAF) 也存在較大差異，表現為二級結構的位置和長度均不一致；
3. β1和β*的位置長度和位置差異較大，二者主鏈RMSD為13.3 Å，值得注意的是，此區域為結合底物蛋白caspase-1/4的區域之一。具體見下圖：

雖然AF預測的IL-18前體蛋白與實驗結構差異較大，作者發現AF預測的結構與成熟的IL-18 (即1-36被caspase-1/4切割后) 的構象吻合得非常好，二者RMSD僅為0.2Å：

通過比較IL-18前體蛋白與caspase-1的復合物結構，作者發現液體核磁結構可以更好地結合caspase-1從而被其切割為成熟體，而AF預測的結構則不利于與caspase-1的相互作用。原因有三點：
1）caspase-1與pro-IL-18的采取一種“雙結合位點”的結合模式，即除活性區域 (pro-domain) 外，位于β1的Ile48與caspase-1中 294位的色氨酸存在相互作用。在AF2預測結構中，二者距離較遠不利于同時與caspase-1發生相互作用，因此可能影響與caspase-1的結合；
2）AF2預測的結構中，pro-IL-18的切割位點 (33-LESD-36) 處臨近β1，而在實驗結構中它位于一段柔性較高的無結構區域而更利于被caspase-1處理；
3）AF2預測結構中，單獨的、伸展的pro-domain在細胞內更容易被其他蛋白酶非特異性切割，不利于IL-18正確地發揮生物功能：

本文提供的這個例子非常直觀地表明AF2尚不能完全替代實驗結構，最好的方法便是結合AF2與實驗數據更快、更準確地對蛋白結構進行解析，這一策略將在后續詳細地介紹，也是現在的研究前沿和熱點。

參考文獻：
1.Bonin et.al., Journal of Magnetic Resonance, 2024.
2.Terwilliger et.al., Nature Methods, 2024.
3.Agarwal et.a., Nature Chemical Biology, 2024.