美白功效體外評估的可視化技術3D黑色素表皮模型的介紹
東方女性以白為美，膚色白皙常常與青春貌美聯系在一起，我國更是有“一白遮三丑”的俗語，因此美白功效產品一直是化妝品研發的熱點。隨著合成生物學蓬勃發展以及《化妝品注冊備案管理辦法》中對新原料的規定，對美白新原料的研發和功效驗證變得更加炙手可熱。在美白化妝品原料或產品研發階段，通常會采用體外試驗方法評估其美白功效，主要包括基于酪氨酸酶活性生化方法、2D單層黑色素細胞生物學方法，體外重建3D皮膚模型替代方法等，不同評估方法在原料/配方產品美白功效篩選的不同階段發揮著不同作用，總體上，美白原料、配方產品功效篩選邏輯就像金字塔一樣如圖1，比如基于重建3D黑色素表皮模型篩選適用于已初步確認有一定美白作用的原料/配方產品篩選。
重建3D黑色素表皮模型以人源正常組織角質形成細胞和黑色素細胞為種子以一定的比例接種于特定生長環境中，經過浸沒培養和氣液培養增殖分化出類似于正常人表皮復層組織結構，模擬人使用化妝品場景多次涂抹于模型表面，可以從黑色素細胞功能、黑色素的合成以及向角質形成細胞的轉運代謝等多個功效機制出發，通過實驗技術獲取基因水平、蛋白水平與組織水平等多維度功效數據，可以對待測樣品進行綜合全面的美白功效評估，比生物化學法和細胞生物學法更系統、更真實反應產品美白功效。
格寧生物（ScreeNingBio，SNB）實驗室于2022年建立了基于體外重建3D黑色素表皮模型Skinovo® -Mela美白功效評估檢測平臺，采用模擬人涂抹化妝品使用場景將一定量待測物多次均勻涂抹于3D模型表面，主要檢測指標包括黑色素相關基因表達、表觀亮度（L值）、模型中黑色素含量，可視化指標包括表觀色度、黑色素分布、模型中黑色素細胞數量、形態和酪氨酸酶活性等如表1。
針對每一個檢測指標進行詳細介紹：
國際照明委員會CIE建立的L*a*b*色度系統，在人體膚色分類、美白化妝品功效評價中得到了普遍認可和應用。其中L*表征表觀亮度，其值越大，顏色越偏向白色，小則越偏向黑色。在美白功效評估數據中，表觀亮度L數據可以原始數據呈現也可以以ΔL數據呈現如圖2。
經過待測物處理后黑色素表皮模型中黑色素含量的變化是衡量待測物美白功效的黃金標準。黑色素是化學結構及其復雜的一類大分子聚合物，一般采用強酸或強堿溶解進行絕對定量或相對定量圖3,4，可以根據客戶需求選擇方法進行實驗。
格寧生物實驗室重點開發了基于3D皮膚模型研究美白功效的可視化技術，表觀色度變化是其中一個可視化指標，待測樣品處理后，把模型放在根據個體類型角（Individual Typological Angle，ITA°）繪制的色度卡如圖5，是通過專業相機拍照觀察不同處理組模型表面黑素沉積的變化，可以肉眼可見、直觀地呈現待測物的美白效果如圖6。
待測物經過皮膚模型表面涂抹并滲透到皮膚模型基底層到達黑色素細胞發揮其美白功效，是如何發揮美白功效、持續涂抹處理后3D表皮模型中黑色素細胞是什么狀態、黑色素合成過程中關鍵限速酶酪氨酸酶活力怎么樣、黑色素分布情況以及如何可視化呈現等等，這些問題一直是美白產品研發過程要解決的問題。 
待測物處理后的黑色素表皮模型進行DOPA 染色和甲醛后固定后，顯微鏡水平拍照可以直觀地呈現基底層的黑色素細胞狀態以及待測樣品處理后細胞差異如圖7,8,9。基于DOPA染色結果，可以看出黑色素細胞呈現了正常的胞體形態表明待測物沒有明顯的毒性，與基質對照組相比，待測樣品組黑色素細胞數量明顯減少，黑色細胞形態多數呈梭形雙極狀，多極樹突狀細胞明顯變少變短，限制了向周圍角質細胞轉運黑色素的能力。黑色素細胞胞體顏色明顯比對照組白，證明酪氨酸酶合成黑色素的活力受到抑制。由此可見，利用3D皮膚模型基于黑色素細胞DOPA染色不僅可以直觀地評價待測物的美白功效，還能從美白機制維度給出證據。
黑色素2D可視化分布采用Fontana-Masson(FM) 嗜銀染色，利用黑色素具有將銀氨溶液還原為金屬銀的特性即嗜銀反應來顯示黑色素，染色后黑色素呈黑色如圖10，是目前常用的黑色素特殊染色的方法之一，將染色后的玻片掃描并用ImageJ分析黑色素面積，分析比較對照組和待測樣品組差異，確定待測樣品的美白功效。
另外，我們可以借助不同的顯微鏡技術掃描3D黑色素表皮模型不同厚度的黑色素，可視化地呈現黑色素的分布和數量變化如圖11,12（可參考https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34822483/）。
重建3D黑色素表皮模型是一種持續生長的特殊生物檢測工具，模型的組織結構、活細胞層數、角質層厚度隨模型培養生長時間發生變化，對待測物的吸收滲透能力也隨之發生改變，所以待測物表面涂抹的時間窗口（Time Window）對檢測結果有很大影響。正常機體條件下黑色素表達水平不高，可以引入物理或化學誘導因素比如紫外線UV、α-MSH刺激等，從組成型表達的黑色素和誘導型表達的黑色素兩個維度研究，對檢測結果的信號窗口（Signal Window）也有很大影響。格寧生物可以根據客戶需求定制方法或者參考國內團標的方法開展待測樣品的美白功效的研究和驗證。
總之，重建3D黑色素表皮模型是研究驗證待測樣品美白功效的有效工具之一，可實現化妝品原料及配方的體外科學檢測并與臨床評估結果保持一致性，不僅可以回答待測物是否有美白功效，還可以回答如何發揮美白功效等調節機制問題，并且具有檢測周期短，成本低、可重現性好等優點。重建3D黑色素表皮模型在美白化妝品以及藥物制劑對調節皮膚色素沉著的功效研發中得到廣泛應用。
重建3D黑色素表皮模型以人源正常組織角質形成細胞和黑色素細胞為種子以一定的比例接種于特定生長環境中，經過浸沒培養和氣液培養增殖分化出類似于正常人表皮復層組織結構，模擬人使用化妝品場景多次涂抹于模型表面，可以從黑色素細胞功能、黑色素的合成以及向角質形成細胞的轉運代謝等多個功效機制出發，通過實驗技術獲取基因水平、蛋白水平與組織水平等多維度功效數據，可以對待測樣品進行綜合全面的美白功效評估，比生物化學法和細胞生物學法更系統、更真實反應產品美白功效。
格寧生物（ScreeNingBio，SNB）實驗室于2022年建立了基于體外重建3D黑色素表皮模型Skinovo® -Mela美白功效評估檢測平臺，采用模擬人涂抹化妝品使用場景將一定量待測物多次均勻涂抹于3D模型表面，主要檢測指標包括黑色素相關基因表達、表觀亮度（L值）、模型中黑色素含量，可視化指標包括表觀色度、黑色素分布、模型中黑色素細胞數量、形態和酪氨酸酶活性等如表1。
針對每一個檢測指標進行詳細介紹：
國際照明委員會CIE建立的L*a*b*色度系統，在人體膚色分類、美白化妝品功效評價中得到了普遍認可和應用。其中L*表征表觀亮度，其值越大，顏色越偏向白色，小則越偏向黑色。在美白功效評估數據中，表觀亮度L數據可以原始數據呈現也可以以ΔL數據呈現如圖2。
經過待測物處理后黑色素表皮模型中黑色素含量的變化是衡量待測物美白功效的黃金標準。黑色素是化學結構及其復雜的一類大分子聚合物，一般采用強酸或強堿溶解進行絕對定量或相對定量圖3,4，可以根據客戶需求選擇方法進行實驗。
格寧生物實驗室重點開發了基于3D皮膚模型研究美白功效的可視化技術，表觀色度變化是其中一個可視化指標，待測樣品處理后，把模型放在根據個體類型角（Individual Typological Angle，ITA°）繪制的色度卡如圖5，是通過專業相機拍照觀察不同處理組模型表面黑素沉積的變化，可以肉眼可見、直觀地呈現待測物的美白效果如圖6。
待測物經過皮膚模型表面涂抹并滲透到皮膚模型基底層到達黑色素細胞發揮其美白功效，是如何發揮美白功效、持續涂抹處理后3D表皮模型中黑色素細胞是什么狀態、黑色素合成過程中關鍵限速酶酪氨酸酶活力怎么樣、黑色素分布情況以及如何可視化呈現等等，這些問題一直是美白產品研發過程要解決的問題。
待測物處理后的黑色素表皮模型進行DOPA 染色和甲醛后固定后，顯微鏡水平拍照可以直觀地呈現基底層的黑色素細胞狀態以及待測樣品處理后細胞差異如圖7,8,9。基于DOPA染色結果，可以看出黑色素細胞呈現了正常的胞體形態表明待測物沒有明顯的毒性，與基質對照組相比，待測樣品組黑色素細胞數量明顯減少，黑色細胞形態多數呈梭形雙極狀，多極樹突狀細胞明顯變少變短，限制了向周圍角質細胞轉運黑色素的能力。黑色素細胞胞體顏色明顯比對照組白，證明酪氨酸酶合成黑色素的活力受到抑制。由此可見，利用3D皮膚模型基于黑色素細胞DOPA染色不僅可以直觀地評價待測物的美白功效，還能從美白機制維度給出證據。
黑色素2D可視化分布采用Fontana-Masson(FM) 嗜銀染色，利用黑色素具有將銀氨溶液還原為金屬銀的特性即嗜銀反應來顯示黑色素，染色后黑色素呈黑色如圖10，是目前常用的黑色素特殊染色的方法之一，將染色后的玻片掃描并用ImageJ分析黑色素面積，分析比較對照組和待測樣品組差異，確定待測樣品的美白功效。
另外，我們可以借助不同的顯微鏡技術掃描3D黑色素表皮模型不同厚度的黑色素，可視化地呈現黑色素的分布和數量變化如圖11,12（可參考https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34822483/）。
重建3D黑色素表皮模型是一種持續生長的特殊生物檢測工具，模型的組織結構、活細胞層數、角質層厚度隨模型培養生長時間發生變化，對待測物的吸收滲透能力也隨之發生改變，所以待測物表面涂抹的時間窗口（Time Window）對檢測結果有很大影響。正常機體條件下黑色素表達水平不高，可以引入物理或化學誘導因素比如紫外線UV、α-MSH刺激等，從組成型表達的黑色素和誘導型表達的黑色素兩個維度研究，對檢測結果的信號窗口（Signal Window）也有很大影響。格寧生物可以根據客戶需求定制方法或者參考國內團標的方法開展待測樣品的美白功效的研究和驗證。
總之，重建3D黑色素表皮模型是研究驗證待測樣品美白功效的有效工具之一，可實現化妝品原料及配方的體外科學檢測并與臨床評估結果保持一致性，不僅可以回答待測物是否有美白功效，還可以回答如何發揮美白功效等調節機制問題，并且具有檢測周期短，成本低、可重現性好等優點。重建3D黑色素表皮模型在美白化妝品以及藥物制劑對調節皮膚色素沉著的功效研發中得到廣泛應用。
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