結直腸癌（CRC）是全球最常見的惡性腫瘤之一，也是導致癌癥相關死亡的主要原因之一。CRC的發生和發展是一個多步驟過程，受到包括遺傳因素和環境因素在內的多種因素的復雜影響。近年來，腸道菌群失調，特別是某些特定細菌，如具核梭桿菌（Fusobacterium nucleatum）、腸毒性脆弱擬桿菌（ETBF）和某些類型的大腸桿菌（E.coli）等，在CRC發生中的作用越來越受到關注。

2024年8月5日，上海仁濟醫院房靜遠教授團隊在著名學術期刊Cell Host & Microbe（IF 20.6）在線發表了題為“BCAA-producing Clostridium symbiosum Promotes Colorectal Tumorigenesis Through the Modulation of Host Cholesterol Metabolism”的研究論文。通過隊列研究、多組學技術、動物模型、功能驗證等多種研究方法，揭示了共生梭菌C.symbiosum及其代謝產物與CRC患者臨床特征的關聯及其致癌機制。（麥特繪譜提供Q300全定量檢測服務）

此前，房靜遠教授團隊多次與麥特繪譜合作在腸菌研究方向發表了多篇研究文章，成果展示如下：

●Fusobacterium nucleatum-derived succinic acid induces tumor resistance to immunotherapy in colorectal cancer（Cell Host & Microbe，2023IF=30.3，麥特繪譜提供Q300全定量檢測服務）

●Disruption of CerS6-mediated sphingolipid metabolism by FTO deficiency aggravates ulcerative colitis（Gut，2023IF=24.5，麥特繪譜提供神經酰胺定量檢測服務）

●Microbiome and metabolome features in inflammatory bowel disease via multi-omics integration analyses across cohorts（Nature Communications，2023IF=16.6，麥特繪譜提供Q300全定量檢測服務）

 

研究思路

圖1. 技術路線

 

研究結果

1. C.symbiosum在CRC患者中的臨床特征

建立臨床隊列，在隊列1中納入130名CRC患者，發現腫瘤組織中的C. symbiosum豐度顯著高于正常組織且C. symbiosum在腫瘤組織中的水平與腫瘤大小呈正相關。根據從公共數據集檢索的宏基因組數據，在幾個西方隊列中進一步驗證了CRC患者糞便中C. symbiosum顯著富集。在隊列2中，對290名結直腸腺瘤（CRA）患者進行有效監測，結果顯示，高C. symbiosum豐度的患者，CRA復發的病例更多。綜合隊列1和隊列2的結果表明C. symbiosum水平不僅在CRC患者的糞便中升高，而且在腫瘤組織中也升高。

圖2. C. symbiosum在腺瘤復發患者中富集，與結直腸癌患者的臨床特征相關

 

2.C. symbiosum促進結直腸癌的發生和生長

根據前文提到的臨床表征，建立了3種細菌缺失小鼠模型，即結腸炎相關癌(CAC)模型、偶氮甲烷(AOM)為基礎的散發性腫瘤模型和ApcMin/+小鼠模型，進一步探索C. symbiosum對結直腸腫瘤發生的影響。在CAC模型中，C. symbiosum灌胃組小鼠的結腸腫瘤數量和腫瘤負荷顯著增加，組織學和免疫組化檢查顯示，C. symbiosum小鼠出現了高級別異型增生，且腫瘤區域和正常上皮中的Ki67陽性細胞（高Ki67表達通常與腫瘤細胞的高度增殖活性和更差的預后相關）比例較高，表明C. symbiosum促進了上皮細胞的增殖。在ApcMin/+小鼠模型和AOM誘導的散發性腫瘤模型中，也得到了類似的結果，證實了C. symbiosum增加了結腸腫瘤數量和腫瘤負荷。

此外，為了排除SPF小鼠受到的常規微生物環境和結腸免疫微環境的影響，采用無菌小鼠模型進行了驗證，結果也證實了C. symbiosum促進結腸腫瘤的發生和生長及Ki67細胞的增殖。

結合體外細胞功能實驗，發現C. symbiosum顯著促進了正常上皮細胞系NCM460和結腸癌細胞系HT29、HCT116的增殖。

圖3. C. symbiosum在體內和體外促進結直腸腫瘤發生和腫瘤生長

 

3.C. symbiosum增強小鼠結腸干細胞特性

進一步剖析C. symbiosum對小鼠結腸組成和功能的影響，對無菌小鼠的結腸組織進行單細胞轉錄組學測序分析，捕獲到14067個細胞，包括多種上皮細胞、免疫細胞和間質細胞。通過研究干細胞標記基因表達情況，發現空白組、AOM/DSS處理組和C. symbiosum定殖AOM/DSS誘導組的干細胞比例逐步增加，表明C. symbiosum可能在結腸干細胞的增殖和更新中扮演重要角色，進而促進結腸腫瘤的發生。基于此結果，從AOM/DSS誘導的小鼠模型中分離出結腸腫瘤干細胞，并進行類器官形成實驗，發現C. symbiosum顯著促進了腫瘤器官樣體的形成和生長。極限稀釋實驗、腫瘤球體和菌落形成實驗也表明了C. symbiosum顯著促進了結腸腫瘤的生長。

圖4. 在體內和體外均可提高結腸干細胞的比例，促進干細胞的形成

 

4. C.symbiosum通過產生BCAAs發揮致癌作用

使用微生物群耗竭的小鼠模型，通過口服給予磷酸鹽緩沖液（PBS）、活的C. symbiosum以及熱殺死的C. symbiosum，同時誘導小鼠發生CRC（使用AOM/DSS模型）。實驗結果顯示，活的C. symbiosum灌胃促進了腫瘤生長，而熱殺死的C. symbiosum則沒有這種效果，表明C. symbiosum可能通過產生生物活性因子來發揮其增殖作用。與此同時，來自C. symbiosum定殖小鼠的糞便代謝產物和CFS（C. symbiosum的無細胞上清液）均能促進CRC細胞系的增殖，進一步支持了C. symbiosum的相關代謝物是其致癌作用的基礎。對C. symbiosum定殖小鼠的糞便樣本進行了全定量靶向代謝組學分析（麥特繪譜提供），發現78種代謝產物顯著改變，其中纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸途徑高度富集，即支鏈氨基酸（BCAAs）在C. symbiosum定殖小鼠的糞便中顯著升高。

使用BCAA缺乏的飲食模型結合C. symbiosum灌胃，發現低BCAA飲食在一定程度上抑制了ApcMin/+小鼠的腫瘤負荷。此外，通過CRISPR-Cas12a系統構建了ilvE基因干擾的C. symbiosum（ilvEi），該菌株BCAA分泌能力顯著降低，其在微生物群耗竭的ApcMin/+小鼠模型中的致癌作用也明顯受到抑制。

圖5. C.symbiosum通過產生BCAAs發揮致癌作用

 

5. C. symbiosum通過mTORC1信號傳導促進細胞膽固醇合成

通過IPA分析三種BCAAs和宿主中與細胞生長和增殖相關的信號節點，發現BCAAs與mTORC1（哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1，細胞生長和代謝的關鍵調節因子）信號通路之間存在高度連接的網絡。scRNA-seq的通路富集分析顯示，在C. symbiosum定植的小鼠中，mTORC1在干細胞群體中是最顯著的通路。

結合體內實驗、體外實驗以及使用雷帕霉素抑制mTORC1進一步證實了C. symbiosum能顯著刺激mTORC1信號，證明了mTORC1在C. symbiosum促瘤過程的關鍵作用。

此外，通過RNA-seq和scRNA-seq的通路富集分析，膽固醇穩態通路均被富集，表明C. symbiosum可能影響膽固醇代謝。在細胞實驗中，與C. symbiosum共培養的NCM460、HT29和HCT116細胞的游離和總膽固醇水平顯著增加，使用雷帕霉素處理顯著降低HCT116細胞中的膽固醇含量，表明mTORC1信號對膽固醇合成有重要影響。

圖6. C. symbiosum通過mTOR信號傳導促進細胞膽固醇合成

 

6. C. symbiosum通過調控膽固醇合成來促進細胞增殖和干細胞特性的機制

qPCR和Western Blot結果顯示NCM460、HT29和HCT116細胞與C. symbiosum共培養時，參與膽固醇合成的基因（HMGCR、LSS、SC5D和DHCR7）mRNA水平在多重感染（MOI）依賴的方式下普遍上調。TCGA-COAD和GETEx數據庫分析顯示了HMGCR在CRC腫瘤樣本中的表達顯著上調，siRNA敲低實驗及患者隊列數據分析也論證了C. symbiosum通過調控HMGCR促進膽固醇合成。

進一步研究C. symbiosum促進細胞增殖和干細胞特性是否依賴于膽固醇合成，使用HMGCR抑制劑辛伐他汀（simvastatin）來阻斷細胞內的膽固醇合成，體內和體外實驗證明了C. symbiosum確實通過調控膽固醇合成來促進細胞增殖。

圖7. 抑制膽固醇合成一定程度消除了C. symbiosum促進的細胞增殖

 

7. C. symbiosum通過誘導膽固醇合成激活Hedgehog信號通路

大量研究表明膽固醇主要是通過觸發Sonic Hedgehog（SHH）信號通路的激活來維持癌細胞干細胞特性，基于此觀點，使用qPCR和免疫印跡技術檢測了SHH信號通路的關鍵節點基因GLI1和SHH的表達，結果顯示C. symbiosum處理以MOI依賴的方式誘導了SHH信號通路的激活，體內實驗和患者的腫瘤活檢樣本中也發現了SHH信號通路的激活。此外，特異性驗證也表明了C. symbiosum對SHH信號通路的特異性影響，WNT和NOTCH信號通路的相關基因mRNA水平并未發生變化。在HT29和HCT116細胞中敲低HMGCR后，C. symbiosum誘導的GLI1和SHH上調被顯著廢除，進一步證明了膽固醇合成在SHH信號通路激活中的關鍵作用。

圖8. C. symbiosum上調細胞膽固醇合成激活hedgehog信號傳導

 

總結

共生梭菌在結直腸癌患者的腫瘤組織中選擇性富集，并與結直腸腺瘤復發率相關，在多種小鼠模型中印證了共生菌的致瘤作用。單細胞轉錄組分析和功能分析表明，C. symbiosum促進結腸癌干細胞的增殖并增強癌癥的干性。通過靶向代謝組學分析，C. symbiosum通過產生支鏈氨基酸來增強細胞膽固醇合成，激活Sonic hedgehog信號傳導。低BCAA攝入或他汀類藥物阻斷膽固醇合成可在體內和體外部分阻斷共生菌誘導的細胞增殖。

 

參考文獻

BCAA-producing Clostridium symbiosum Promotes Colorectal Tumorigenesis Through the Modulation of Host Cholesterol Metabolism. Cell Host & Microbe. 2024

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繪譜幫你測

本研究中使用Q300全定量靶向代謝組學技術對C. symbiosum定殖小鼠的糞便樣本進行分析，發現纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸顯著升高，成為本文科研思路的重要線索，為之后發現膽固醇調控機制奠定基礎。麥特繪譜開創性地搭建了醫學領域高端代謝組學技術平臺，覆蓋了非靶向-全定量-代謝流等全方位的高端醫學代謝組解決方案，同時全面布局微生物組學、轉錄組學和蛋白質組學等多組學技術服務，已成為全球多組學研究者的優選合作伙伴。麥特繪譜擁有Q1000，Q500、Q300、Q200和膽汁酸、短鏈脂肪酸、色氨酸及咧咪衍生物、多胺和TMAO類等各類小分子代謝物、非靶向代謝組學和同位素示蹤代謝流技術等共40+系列檢測方法；已為數百家三甲醫院、科研院所和企業提供多組學解決方案，協助客戶與合作伙伴發表SCI文章400+篇，累計影響因子4000+，平均IF>10，包括Cell, Nature, Science, Cell Metabolism, Immunity, Gut, Hepatology, Microbiome等權威期刊。