編者按

阿爾茲海默癥（AD）是一種神經退行性疾病，會導致認知能力下降。神經炎癥是AD的病理特征之一，主要由小膠質細胞驅動。為了研究年齡和APOE基因型對小膠質細胞的影響，本文利用單細胞轉錄組、可及性檢測和多重原位轉錄組檢測技術，整合單細胞與空間組學數據，繪制了AD小膠質細胞圖譜，鑒定出一種新的耗竭樣小膠質細胞群體，解析其功能以及與AD進展的關系。

01 研究背景

阿爾茲海默癥（AD）是一種無法治愈的神經退行性疾病，其特征是進行性突觸功能障礙、神經元丟失和認知能力下降。β 淀粉樣蛋白 (Aβ) 肽的過度積累和過度磷酸化tau蛋白的聚集是AD大腦的主要病理特征，其次是神經炎癥，這被認為主要是由小膠質細胞驅動。小膠質細胞是經典神經炎癥的中心介質，異質性高，以不同的狀態存在于AD大腦中，可能對疾病進展有利或有害，然而決定特定小膠質細胞群是否限制或促進AD病理的因素仍然不明確。為了表征AD腦中小膠質細胞的變化，本文對不同年齡和不同APOE基因型小鼠腦中免疫細胞進行單細胞轉錄組和染色質可及性（ATAC）分析，結合多重原位轉錄組檢測技術，系統地描繪了神經免疫系統的復雜動態，鑒定到一個新的炎癥小膠質細胞群體，并多角度解析其特征和對AD發展的影響。

02 文章詳情

文章題目：An exhausted-like microglial population accumulates in aged and APOE4 genotype Alzheimer's brains

中文題目：衰老和APOE4基因型阿爾茨海默癥大腦中積累了耗竭樣的小膠質細胞群

發表時間：2024.01

期刊名稱：Immunity

影響因子：32.4

實驗平臺：10x Genomics單細胞轉錄組測序+ATAC+多重原位轉錄組檢測

DOI：10.1016/j.immuni.2023.12.001

03 技術路線

為了方便各位老師快速掌握研究思路，小編繪制了文章的研究框架圖，供各位觀賞。

04 研究結果

1. 單細胞轉錄組測序在AD小鼠中鑒定到一個TIM細胞群

首先構建攜帶有不同APOE等位基因的AD小鼠，并對10、20和96周小鼠的海馬和皮層組織進行取樣、分選免疫細胞（CD45+）并進行單細胞轉錄組測序。細胞注釋后將其中的小膠質細胞進行再聚類，發現一群高表達炎癥和早反應基因的細胞，幾乎僅存在于96周小鼠中，且在APOE4基因型中比例高于APOE3基因型。速率算法發現穩態小膠質細胞通過急性和慢性炎癥小膠質細胞群向這一群年齡特異性小膠質細胞群流動。因此，研究者將這群細胞命名為終末炎癥性小膠質細胞（TIM）。TIM可分為兩個主要亞群，一個高表達效應器marker（effector-hi TIM），另一個則高表達應激marker（effector-lo TIM）。effector-lo TIM在APOE4基因型AD小鼠中比例更高，而effector-hi TIM在APOE2基因型小鼠中比例更高，說明TIM的異質性在AD環境中受APOE基因型調控。

Fig.1 年齡和APOE基因型依賴的AD神經免疫圖譜

2. TIM在轉錄調控、細胞通訊和代謝方面的特征

利用SCENIC算法確認TIM的驅動轉錄因子，發現TIM與核因子(NF)-kB和CEB/P家族轉錄因子驅動的一系列炎癥調控因子以及多個AP-1家族轉錄因子密切相關。相對于穩態小膠質細胞，TIM在一些炎癥調控因子（Nfkb2、Irf1、Irf3和Irf4）中富集，但在其他因子（Irf5、Irf7、Irf9和Stat1/2）中減少，表明可能有特定炎癥途徑的潛在選擇性調節。

利用CellPhoneDB分析小膠質細胞與其他免疫細胞間的通訊關系，發現TIM表現出減少炎癥和降低激活的傾向。TIM中的TGF-β信號相對于疾病相關小膠質細胞（DAM）和穩態小膠質細胞減少，表明TIM通過其他機制獲得炎癥減輕的表型。此外，在微環境中，TIM促進炎癥的能力減弱。

利用Compass分析發現細胞能量代謝通路、糖酵解/糖異生途徑以及糖類的代謝通路在TIM中減少，而與活性氧（ROS）解毒和多種氨基酸代謝相關的通路在TIM中增加。

Fig.2 TIMs由獨特的轉錄程序、相互作用和代謝狀態定義

3. 單細胞多組學揭示TIM轉錄調控的介質

為了補充從20到96周齡小膠質細胞的發育特征，并且從轉錄組和轉錄調控兩個組學來表征小膠質細胞，研究者利用單細胞核轉錄組和ATAC檢測技術分析60周齡AD小鼠海馬和皮層組織的免疫細胞，發現有一個小膠質細胞亞群表達模式與TIM相似，其比例高于20周齡小鼠，低于96周齡小鼠，說明TIM在60周齡時已經以較高水平可檢測，并且隨后以年齡依賴的方式繼續積累。TIM的marker基因在表達和可及性方面具有高度一致性。對ATAC結果進一步分析發現ETS轉錄因子家族特異性富集于TIM中。此外，SCENIC+、CellPhoneDB和Compass的分析結果表明，60周齡與96周齡的TIM在轉錄調控、細胞互作和代謝上特征一致。

Fig.3 60周齡AD*APOE4小鼠的單細胞轉錄組+ATAC測序表明TIMs的調控特征

4. TIM存在于晚期AD患者中，并隨著年齡和APOE4增加而增多

為了確認在小鼠中發現的TIM是否真實存在于人腦中，研究者對已發表的人腦單細胞核轉錄組測序結果的小膠質細胞進行分析，并成功鑒定到TIM的存在，在AD患者中比例高于健康人，并隨著布雷克分級（衡量AD進展的組織病理學指標）增加而增加。攜帶APOE4等位基因的患者比APOE3/APOE3患者的TIM比例更高。建模分析表明，布雷克分級和APOE4等位基因計數是TIM比例的強預測因子。在一個小鼠跨年齡單細胞轉錄組圖譜中發現TIM的比例隨年齡增加而增加。

Fig.4 TIM存在于公開的人單細胞核轉錄組測序數據集

5. 腦皮層中TIM分布區域富含Aβ斑塊和炎性細胞

為了確認空間水平上TIM的分布特征，研究者利用多重原位轉錄組檢測技術對6位AD患者（3位APOE4純合子和3位APOE3純合子）切片進行分析。其中，APOE4純合子中TIM比例更高，空間鄰域分析發現TIM與TIM、L5神經元和兩種特定的星形膠質細胞相鄰概率更高。APOE4中的 TIM 更有可能與神經元和這兩個星形膠質細胞群聚集，而APOE3 中的 TIM 更可能與少突膠質細胞（多數位于白質中）相鄰，說明APOE4基因型與 TIM比例增加以及這些TIM與灰質更接近相關。此外，在含有高Aβ的區域中檢測到TIM，表明 TIM 在Aβ相關發病機制中具有潛在作用。

Fig.5 TIM富集在攜帶 APOE4 的AD 患者的皮質層中

6. TIM的Aβ吞噬和清除能力缺陷

接下來，研究者將60周齡不同APOE基因型的AD小鼠海馬和皮層中的細胞與熒光標記的Aβ體外共培養、分選（CD45+），并根據熒光信號高低分為2管（熒光信號高說明細胞吸收Aβ的量高，反之則低），進行單細胞轉錄組測序。結果表明，Aβ吸收少的細胞群體向TIM靠攏，Aβ吸收高的細胞群體中effector-lo和effector-hi TIM比例低，且在APOE4基因型中effector-lo更低，說明該基因型中該細胞群體的 Aβ 清除缺陷更加嚴重，導致該基因型患者負擔更重的復合效應。

Fig.6 TIM的Aβ清除功能受損

7. 阿杜那單抗治療可調節 TIM 的比例和相互作用

阿杜那單抗通過選擇性結合Aβ聚合體來減緩疾病進展。為了剖析該藥物如何影響晚期疾病中TIMs的出現和行為，研究者給60周齡的AD小鼠注射阿杜那單抗或同種型對照并進行單細胞轉錄組測序，發現effector-hi TIM在藥物處理組比例更高，而effector-lo TIM在對照組比例更高。互作分析發現阿杜那單抗治療和 APOE4 均與預測的相互作用更多和平均預測相互作用強度越高相關，阿杜那單抗治療在APOE2中較難驅動小膠質細胞對Aβ的反應，而在APOE3/4中則相反。在免疫細胞互作關系中，治療作用顯著增加了適應性免疫細胞總相互作用，且在APOE4中增加更多。與B和T細胞的互作信號中，信號增長最大的是effector-hi TIM，表明這種細胞在協調炎癥期間的細胞間通信網絡時可能特別關鍵，effector-hi TIM可能是對aducanumab治療的適應性免疫反應的中心協調者。

Fig.7 阿杜那單抗治療深刻改變了AD環境中免疫細胞的格局

05 主要結論

本研究在攜帶三種常見人 APOE 等位基因的AD模型小鼠中生成了腦免疫細胞的綜合縱向單細胞圖譜。轉錄組和染色質可及性分析確定了一個反應性小膠質細胞群體，其表達炎癥信號和細胞內在應激marker，比例隨著年齡和 APOE4 負擔而增加。使用多重原位轉錄組技術在AD患者的大腦中檢測到類似的群體，包括在皮質組織中。這一群體被命名為終末炎癥小膠質細胞 (TIM)，在阿杜那單抗治療期間表現出Aβ清除缺陷和細胞間通訊改變。TIM 可能代表 AD 環境中炎癥小膠質細胞的類耗竭狀態，導致APOE4攜帶者和老年人的 AD 風險和病理，從而為 AD 提供潛在的治療靶點。

參考文獻：

Millet, Alon et al. “An exhausted-like microglial population accumulates in aged and APOE4 genotype Alzheimer's brains.” Immunity vol. 57,1 (2024): 153-170.e6.