多重熒光免疫組化技術原理和流程及其應用實例
多重熒光免疫組化技術(Multiplex immunohistochemical，mIHC) 也稱作酪氨酸信號放大 (Tyramide dignal amplification，TSA) 技術，是一類利用辣根過氧化酶(Horseradish Peroxidase, HRP) 對靶蛋白或核酸進行高密度原位標記的酶學檢測方法。
該方法基于酪胺信號放大的多重順次免疫染色技術，允許同時檢測單個細胞或組織樣本上的多個目標靶點，全面研究細胞組成、細胞功能和細胞間相互作用。
mIHC 實驗原理及流程
TSA 技術采用 HRP 標記的二抗，HRP 催化加入體系的 TSA 衍生熒光染料，生成活化熒光底物，活化底物可與抗原上的酪氨酸共價結合，將信號共價結合到抗原上。之后用熱修復洗去非共價結合的抗體，再換下一種一抗來第二輪孵育，換另一種熒光素底物，如此往復就可實現多重標記。
mIHC 借助于不同的熒光染料標記，通過多輪染色循環實現組織或細胞的原位多靶點染色[2]。
Tips：
原理：帶有染料標記的底物酪胺 (T) 分子在過氧化氫氧化環境下，被抗體或探針固定的 HRP 轉化為具有短暫活性的中間狀態 (T*)，然后被激活的中間態分子 (T*) 迅速與相接蛋白分子的富含電子區域 (酪氨酸殘基) 進行穩定的共價結合，未被標記的酪胺分子將被洗脫，借此實現對抗原的特異性染色。由于相接的蛋白 (包括 HRP，抗體，目標抗原) 都含有大量的酪氨酸結合位點，所以目標抗原處會富集大量標記分子，使信號被有效放大 (圖 2)。
■ IHC 與 mIHC
免疫組化，是應用抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑顯色來確定組織細胞內抗原，對其進行定位、定性的研究。
：簡單來說，mIHC 屬于 IHC 的升級版本！
Tips：相同點：能夠完整顯現組織原位形態信息。
不同點：
1. 常規免疫組化的分析屬于定性分析，其判斷大多依賴于經驗，其分析結果會有差異。而多重熒光免疫組化屬于定量分析，其利用軟件可對組織中的細胞進行精準的結果分析。
2. 常規免疫組化受傳統染色成像的限制，靶標少于 3 個，無法完整分析組分信息。而多重熒光免疫組化可實現多因子共定位，可以獲取更多的生物信息，且樣本需求量較少。
圖 4. 癌組織單色 IHC（上）和多色譜 mIHC（下）驗證[3]
■ mIHC 與 IF
那么問題來了，mIHC 與 IF 又有什么區別呢？既然最后的成像都是熒光圖像，那按照 IF 實驗就行哇，為什么要去做 mIHC 呢？？？
：其實，mIHC 作為一種新型的免疫化學技術，其價值自然會優于傳統的 IF 實驗，并且二者在原理及操作步驟上均有差異。
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圖 3. mIHC（左）和常規三色熒光檢測示意圖（右）
應用實例
■ 應用一：腫瘤機制探究
Gang Wei 等人收集了透明細胞腎細胞癌 (ccRCC) 患者的腎周脂肪 (Perinephric adipose tissue, PAT) 和皮下白色脂肪 ( White adipose tissue,WAT) 組織樣本，發現腫瘤鄰近脂肪細胞的解偶聯蛋白 1 (Uncoupling protein 1, UCP1) 表達高于遠端脂肪細胞（WAT 褐變的典型特征之一是 UCP1 的表達上調）。
此外，腫瘤細胞的 qRT-PCR、mIHC 檢測和免疫印跡均表明，在聯合注射 BAC-shPgc1a或 BAC-shUcp1 相關的腫瘤中，脂肪細胞促進的 UCP1 水平上調被抑制(圖 4)。
進一步的研究發現，ccRCC 細胞分泌甲狀旁腺激素相關蛋白 PTHrP 以通過 PKA 激活促進 PAT 褐變，而 PAT 介導的產熱導致過量乳酸的釋放以增強 ccRCC 的生長、侵襲和轉移色[2]。
圖 4. UCP1 水平變化的檢測[4]
mIHC (A), qRT-PCR (BG) and Immunoblotting (C) 檢測 UCP1 水平。空白對照組：786-O; 陰性對照組：786-O+BAC-Scramble；敲低 Pgc1a 實驗組：786-O+ BAC-shPgc1a；敲低Ucp1實驗組：786-O+ BAC-shUcp1。
■ 應用二：免疫抑制性腫瘤微環境鑒定
Halse, H 等人運用 mIHC 對轉移性黑色素瘤中的免疫亞群進行精準定位，數據量化了腫瘤內 (Intra-tumor, IT) 與腫瘤基質 (Peri-tumoral, stroma) 的免疫亞群數量，以及免疫亞群與 (Tumor margin, TM) 的距離。
如圖所示，使用 mIHC 在特定腫瘤區域分析轉移性黑色素瘤中免疫亞群的精確位置，觀察不同免疫亞群在瘤內的表達情況。結果顯示，對于黑色素瘤的 MelTIL026 (盆腔淋巴結) 切片，大多數 T 細胞為 CD4+T 細胞，且在腫瘤邊緣 (TM) 和間質區域 (S) 突出，在腫瘤內 (IT) 區域 CD4+和 CD8+T細胞數量較少。
MCE 提供用于 mIHC 所需要的 Vari Fluor TSA 系列染料 ，可用于高密度原位標記檢測。Vari Fluor TSA 系列通過辣根過氧化物酶 (HRP) 靶向抗原，基于酪胺的信號放大技術能夠提供極強的靈敏度、檢測極微量的目的抗原。熒光波長范圍較窄，可以很好的避免 mIHC 實驗中的串色影響。
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貨號 |
產品名稱 | Ex/Em (nm) |
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Vari Fluor 350 TSA（200×） |
347/448 |
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Vari Fluor 488 TSA（200×） |
490/515 |
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Vari Fluor 532 TSA（200×） |
527/558 |
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Vari Fluor 555 TSA（200×） |
555/565 |
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Vari Fluor 594 TSA（200×） |
590/617 |
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Vari Fluor 640 TSA（200×） |
617/639 |
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| HY-D1831 | Vari Fluor 620 TSA（200×） | 617/639 |
| HY-D1833 | Vari Fluor 680 TSA（200×） | 617/639 |
| HY-D1839 | Biotin TSA（200×） | / |
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參考文獻
[1] Taube JM, et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation [published correction appears in J Immunother Cancer. 2020 Jun;8(1):]. J Immunother Cancer. 2020;8(1):e000155.
[2] Tan WCC, et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commun (Lond). 2020;40(4):135-153.
[3] Zhang W, et al. Multiplex immunohistochemistry indicates biomarkers in colorectal cancer. Neoplasma. 2021;68(6):1272-1282.
[4] Wei G, et al. The thermogenic activity of adjacent adipocytes fuels the progression of ccRCC and compromises anti-tumor therapeutic efficacy. Cell Metab. 2021;33(10):2021-2039.e8.
[5] Halse H, et al. Multiplex immunohistochemistry accurately defines the immune context of metastatic melanoma. Sci Rep. 2018;8(1):11158. Published 2018 Jul 24.
