蛋白的重組表達是指將外源基因克隆在含有特定啟動子的表達載體中，讓其在大腸桿菌中在IPTG的誘導(dǎo)下過量表達。

蛋白質(zhì)純化的第一步是在細(xì)胞宿主中表達蛋白質(zhì)。制備的pET28-His6-GFP含有iptg誘導(dǎo)的His6-GFP。一旦細(xì)胞開始生長，將通過添加IPTG“誘導(dǎo)”它們制造蛋白質(zhì)。然后將讓它們繼續(xù)生長并生產(chǎn)蛋白質(zhì)幾個小時，然后通過離心收集細(xì)胞。

材料

1mL過夜培養(yǎng)的由pET28-His6-GFP轉(zhuǎn)化的BL21細(xì)胞

1000X 卡那霉素原液

100M IPTG儲備液

50mL液體LB培養(yǎng)基

步驟

1. 在50mL LB中加入1000X卡那霉素，使最終濃度為1X。攪拌均勻。

2. 將過夜培養(yǎng)液1:100稀釋到50mL LB中，并加入1X卡那霉素。在37°C搖晃培養(yǎng)。定期取1mL樣品檢查OD600(測量細(xì)菌濃度)。

3. 當(dāng)OD600達到0.6-1.0(大約2小時)時，將IPTG加入，最終濃度為500µM。這將誘導(dǎo)His6-GFP蛋白的表達。

4. 將培養(yǎng)液在37°C搖晃16-24小時，使其生長并表達GFP。請注意，在某些情況下，誘導(dǎo)后降低溫度可能有助于蛋白質(zhì)折疊。

5. 16-24小時后，將培養(yǎng)液倒入50mL錐形管中。

6. 將顆粒細(xì)胞在離心機中以4000g旋轉(zhuǎn)10分鐘。記得要平衡離心機!

7. 將上清液倒入廢液容器中(靠近水槽)。我們將漂白介質(zhì)，以確保介質(zhì)中殘留的細(xì)菌在排入下水道之前被殺死。

8. 冷凍細(xì)胞顆粒，直到準(zhǔn)備好開始蛋白質(zhì)純化。