Nature文獻解讀：具有更持續更強的殺傷力的改良T細胞
TCR-T，CAR-T等細胞治療是目前很有前途的腫瘤療法，是將患者自身的T細胞進行改造得來，但是狡猾的腫瘤細胞不會束手就擒，T細胞在殺傷腫瘤細胞過程中會衰竭，殺傷能力大大減弱。最新的一篇《Nature》文章通過改造T細胞的基因，對T細胞充能，使其具備持續殺傷腫瘤細胞的能力，而且擊殺效率更高[1]！
來自Gladstone–UCSF基因免疫學研究所的科研人員，通過CRISPR基因編輯方法發現了一個RASA2基因可以使得T細胞在多種免疫抑制劑的情況下依然能保持增殖，RASA2是一種RASgtpase激活蛋白(RasGAP)，也是人類T細胞的信號檢查點，在急性T細胞受體刺激時下調。
這篇文章用的主流技術就是Incucyte® 實時活細胞分析系統，對T細胞體外殺傷活性做了全面分析：
1 在免疫抑制下能不能殺
2 低靶點表達量下能不能殺
3 能殺多久
4 TCR-T和CAR-T能不能都殺
T細胞“充能”基因篩選方法
將CRISPR基因編輯后的T細胞用CFSE染色，加入各種免疫抑制劑或者Treg細胞（一種可以負調節T細胞活性的細胞），通過FACS篩選能提高T細胞增殖活性的基因，發現RASA2敲除的T細胞在所有免疫制劑存在下仍具有增殖活性。Sartorius的iQue® 高通量流式細胞儀（點擊查看產品手冊）非常適合這個篩選工作。
左圖：用FACS測試，低CFSE信號的細胞群百分比越高，則增殖（Dividing）活性越高。右圖：RASA2敲除的T細胞，在諸如Adenosine等免疫抑制劑存在下具有更多的CFSE低信號的細胞群，說明其仍居有良好的增殖活性。
敲除RASA2的T細胞
在免疫抑制條件下仍有殺傷活性
為了驗證敲除RASA2基因的T細胞活性，作者構建了CD19陽性和NY-ESO- 1陽性的腫瘤細胞，目前T細胞治療手段主要是TCR-T和CAR-T，作者同時構建了針對CD19和NY-ESO-1的CAR（嵌合抗原受體）和TCR（T細胞受體），并用Incucyte® 測試了TCR-T和CAR-T在各種免疫抑制劑和Treg細胞存在下的殺傷活性。
針對NY-ESO-1的TCR-T在Treg細胞存在下對腫瘤細胞的殺傷作用：用Incucyte® 實時檢測腫瘤細胞A375-RFP+細胞數量。對照組在Treg細胞存在情況下對腫瘤細胞殺傷作用減弱，而RASA2 KO細胞不受Treg細胞影響。
TCR-T對NY-ESO- 1陽性的腫瘤細胞的殺傷作用：RASA2敲除的T細胞在各種免疫抑制劑下的殺傷作用比對照強。Incucyte® 實時檢測A375-RFP+細胞數量。
敲除RASA2的T細胞
能增加殺傷活性
作者構建了不同CD19+表達水平的Nalm6腫瘤細胞，并將anti-CD19的CAR基因轉染到RASA2敲除的T細胞建立針對CD19的CAR-T細胞療法。繼續用Incucyte® 檢測CAR-T的細胞殺傷活性，發現RASA2 KO的T細胞通過提高對靶點表達量敏感度來增加殺傷作用。
不同效靶比，不同CD19表達量的腫瘤細胞的殺傷作用發現，RASA2敲除的T細胞對CD19表達量很低的腫瘤細胞具有良好的殺傷作用。用Incucyte® 檢測和計算死細胞染料Annexin V的熒光面積。
敲除RASA2的T細胞
具有持續殺傷活性
體外細胞殺傷往往只有幾天時間，為了檢測T細胞的持續殺傷效果，作者進行了6輪殺傷，每次殺傷持續72小時。
左圖：TCR-T細胞殺傷實驗發現即使在第六輪（Last Stim），與對照相比，RASA2 KO的T細胞殺傷作用依然明顯。
右圖：CAR-T細胞殺傷實驗發現即使在第六輪（Last Stim），與對照相比，RASA2 KO的T細胞殺傷作用依然明顯。
CAR-T細胞殺傷實驗發現即使在第六輪（Last Stim），與對照相比，RASA2 KO的T細胞殺傷作用依然明顯。
本文用Incucyte® 做了包括TCR-T，CAR-T以及持續殺傷各種細胞殺傷實驗，為什么選用Incucyte® 呢？
如果您不想再把細胞拿進拿出的拍攝，來試試Incucyte® 吧！
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下載《CAR-T 細胞進行表型和功能表征》白皮書，了解更多Incucyte® 實時活細胞成像技術與iQue® 高通量流式在腫瘤免疫學中的應用。
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-參考文獻-
RASA2 ablation in T cells boosts antigen sensitivity and long-term function.Nature 2022
來自Gladstone–UCSF基因免疫學研究所的科研人員，通過CRISPR基因編輯方法發現了一個RASA2基因可以使得T細胞在多種免疫抑制劑的情況下依然能保持增殖，RASA2是一種RASgtpase激活蛋白(RasGAP)，也是人類T細胞的信號檢查點，在急性T細胞受體刺激時下調。
這篇文章用的主流技術就是Incucyte® 實時活細胞分析系統，對T細胞體外殺傷活性做了全面分析：
1 在免疫抑制下能不能殺
2 低靶點表達量下能不能殺
3 能殺多久
4 TCR-T和CAR-T能不能都殺
T細胞“充能”基因篩選方法
將CRISPR基因編輯后的T細胞用CFSE染色，加入各種免疫抑制劑或者Treg細胞（一種可以負調節T細胞活性的細胞），通過FACS篩選能提高T細胞增殖活性的基因，發現RASA2敲除的T細胞在所有免疫制劑存在下仍具有增殖活性。Sartorius的iQue® 高通量流式細胞儀（點擊查看產品手冊）非常適合這個篩選工作。
左圖：用FACS測試，低CFSE信號的細胞群百分比越高，則增殖（Dividing）活性越高。右圖：RASA2敲除的T細胞，在諸如Adenosine等免疫抑制劑存在下具有更多的CFSE低信號的細胞群，說明其仍居有良好的增殖活性。
敲除RASA2的T細胞
在免疫抑制條件下仍有殺傷活性
為了驗證敲除RASA2基因的T細胞活性，作者構建了CD19陽性和NY-ESO- 1陽性的腫瘤細胞，目前T細胞治療手段主要是TCR-T和CAR-T，作者同時構建了針對CD19和NY-ESO-1的CAR（嵌合抗原受體）和TCR（T細胞受體），并用Incucyte® 測試了TCR-T和CAR-T在各種免疫抑制劑和Treg細胞存在下的殺傷活性。
針對NY-ESO-1的TCR-T在Treg細胞存在下對腫瘤細胞的殺傷作用：用Incucyte® 實時檢測腫瘤細胞A375-RFP+細胞數量。對照組在Treg細胞存在情況下對腫瘤細胞殺傷作用減弱，而RASA2 KO細胞不受Treg細胞影響。
TCR-T對NY-ESO- 1陽性的腫瘤細胞的殺傷作用：RASA2敲除的T細胞在各種免疫抑制劑下的殺傷作用比對照強。Incucyte® 實時檢測A375-RFP+細胞數量。
敲除RASA2的T細胞
能增加殺傷活性
作者構建了不同CD19+表達水平的Nalm6腫瘤細胞，并將anti-CD19的CAR基因轉染到RASA2敲除的T細胞建立針對CD19的CAR-T細胞療法。繼續用Incucyte® 檢測CAR-T的細胞殺傷活性，發現RASA2 KO的T細胞通過提高對靶點表達量敏感度來增加殺傷作用。
不同效靶比，不同CD19表達量的腫瘤細胞的殺傷作用發現，RASA2敲除的T細胞對CD19表達量很低的腫瘤細胞具有良好的殺傷作用。用Incucyte® 檢測和計算死細胞染料Annexin V的熒光面積。
敲除RASA2的T細胞
具有持續殺傷活性
體外細胞殺傷往往只有幾天時間，為了檢測T細胞的持續殺傷效果，作者進行了6輪殺傷，每次殺傷持續72小時。
左圖：TCR-T細胞殺傷實驗發現即使在第六輪（Last Stim），與對照相比，RASA2 KO的T細胞殺傷作用依然明顯。
右圖：CAR-T細胞殺傷實驗發現即使在第六輪（Last Stim），與對照相比，RASA2 KO的T細胞殺傷作用依然明顯。
CAR-T細胞殺傷實驗發現即使在第六輪（Last Stim），與對照相比，RASA2 KO的T細胞殺傷作用依然明顯。
本文用Incucyte® 做了包括TCR-T，CAR-T以及持續殺傷各種細胞殺傷實驗，為什么選用Incucyte® 呢？
- 培養箱內可長達數周的連續觀察，最短幾分鐘間隔拍攝，減少人力，防止過多操作對細胞的傷害；這篇文章最長做了共計18天的六輪殺傷實驗，每隔2-3小時自動拍攝。
- 6個板位，分別獨立設置檢測程序，可以兼容各種孔板和培養皿，通量高；這篇文章有各種免疫抑制劑、效靶比等實驗組，Incucyte® 一次可以完成所有實驗組實驗。
- 高效簡便的模塊化軟件設置和數據分析，輸出圖片、視頻、生長曲線等多指標多參數；本文主要用到熒光計數并歸一到第一時間點等功能。
- 大于100種優化過的活細胞專用熒光試劑、耗材及詳盡的Protocol。本文用了配套的Annexin V試劑。
如果您不想再把細胞拿進拿出的拍攝，來試試Incucyte® 吧！
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-參考文獻-
RASA2 ablation in T cells boosts antigen sensitivity and long-term function.Nature 2022
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