急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukaemia, AML)是最高發的一種成人血癌。雖然 2/3 的AML患者經化療和靶向治療后能達到完全緩解，但是高達60% - 65%的年輕成人患者會在三年內復發，致使生存率急劇下降。治療性的寡核苷酸(ASO)可高特異性地與癌基因結合，并使其沉默，是一種極具前景的AML治療策略。然而，目前可安全、有效遞送ASO的方法還相對匱乏。

細胞外囊泡(EVs)作為新一代的遞送工具，在解決ASO遞送難題中極具潛力。然而由于產量的限制，基于EV的藥物遞送方法尚處在早期階段。血細胞是非常理想的EVs來源。在細胞體外培養體系中，細胞密度通常為~1E6 cells/mL，但人血液中的紅細胞(red blood cells, RBC)濃度就可高達5E6 cells/uL。因此，RBCs來源的EVs(RBCEVs)在作為遞送載體時具有其天然優勢。

新加坡國立大學的Minh T. N. Le團隊及合作者們建立了大規模純化RBCEVs的標準方法，從每單位的血液(200 mL全血)中可以快速獲取高達10¹³-10¹⁴ EVs，這些RBCEVs被用于裝載包括ASOs、gRNAs以及Cas9 mRNA在內的多種核酸藥物，在人類細胞和異種移植小鼠模型中均展示出高度穩定的miRNA抑制以及CRISPR-Cas9基因編輯能力。

近日該團隊在Cell Proliferation(IF = 8.8)上發表題為“CD33-targeting extracellular vesicles deliver antisense oligonucleotides against FLT3-ITD and miR-125b for specific treatment of acute myeloid leukaemia”的研究型文章。通過對紅細胞來源的EVs(Red Blood Cell-derived EVs, RBCEVs)表面修飾靶向抗體和內部裝載ASO，開發了一種用于AML治療的靶向ASO藥物遞送系統，極大地提高了治療效果(圖1)。

結果顯示，靶向修飾了CD33抗體的RBCEVs可以被AML細胞高效吸收，同時RBCEVs內部裝載的ASO則顯著降低了AML細胞中FLT3-ITD或miR-125b的水平。

 

圖1. 紅細胞來源EVs的工程化流程圖

紅細胞來源的RBCEVs可以被白血病癌細胞吸收，也會在非癌細胞中積累，CD33作為一種常見的白血病標志蛋白，在絕大多數AML細胞表面高表達。由于成熟紅細胞缺乏基因組，無法通過基因工程手段對其改造，作者創新性地開發了一種酶—生物素/鏈霉素—抗體連接的新策略，以實現靶向蛋白與EVs的穩定、高效連接 (圖2)。

圖2. EVs表面靶向抗體修飾策略

作者首先利用NanoFCM對該靶向抗體的修飾結果進行了分析，結果表明成功修飾CD33抗體的EVs可達74.8%，且同型對照IgG的修飾比例為73.6%，說明該方法在連接過程中對修飾蛋白本身無選擇性，理論上可用于在EVs表面修飾任何感興趣的目標蛋白。

圖3. NanoFCM評估EVs靶向抗體修飾效果

后續作者驗證了修飾CD33抗體的RBCEVs可被AML細胞高效吸收。體內實驗表明，CD33修飾的EVs可以顯著的在小鼠骨髓、肝臟、脾臟等部位富集，表明CD33抗體的修飾，使得RBCEVs可特異性的進入白血病相關細胞。作者進一步在RBCEVs中分別裝載FLT3-ITD ASO和miR-125b ASO這兩種藥物，結果顯示這些裝載了ASO的RBCEVs可以顯著抑制白血病的進展。

圖4.  靶向修飾和裝載ASO的RBCEVs治療白血病效果

總結

1.無細胞核和線粒體DNA，有效避免了水平基因轉移的風險；

2.紅細胞數量多，是人體內最豐富的細胞類型（其含量占所有體細胞的84%）；

3.紅細胞易獲取，幾十年來的常規輸血已經證實了它的安全性；

4.RBCEVs穩定性好，在-80℃條件下可長期穩定保存，即使經過多次凍融仍可維持結構完整。基于電穿孔等成熟裝載方法，可有效實現RBCEVs中ASOs的裝載，且該表面蛋白修飾策略的開發也極大提高了RBCEVs靶向AML相關細胞的能力，從而顯著抑制白血病的進展。

RBCEVs的遞送策略加速和推進著治療性ASOs的臨床轉化，這將為白血病患者帶去福音。

本文的通訊作者Minh T. N. Le博士是Carmine Therapeutics的創始人和Advisor。Carmine Therapeutics是一家專注于利用紅細胞膜EVs發展創新基因療法的生物科技企業，公司愿景是使基因藥物廣泛普及，以滿足患者未滿足的醫療需求。在2020年6月，Carmine與武田制藥簽訂超9億美元的科研合作協議，致力于發現、開發以及商業化非病毒基因療法，基于前者開發的紅細胞胞外囊泡的REGENT平臺實現兩種罕見疾病相關靶標的開發和商業化。

參考文獻

· Chen H, Jayasinghe M K, Yeo E Y M, et al. CD33‐targeting extracellular vesicles deliver antisense oligonucleotides against FLT3‐ITD and miR‐125b for specific treatment of acute myeloid leukaemia[J]. Cell Proliferation, 2022: e13255.

· Pham C T, Zhang X, Lam A, et al. Red blood cell extracellular vesicles as robust carriers of RNA-based therapeutics[J]. Cell Stress, 2018, 2(9): 239.

· Usman W M, Pham T C, Kwok Y Y, et al. Efficient RNA drug delivery using red blood cell extracellular vesicles[J]. Nature communications, 2018, 9(1): 1-15.