細(xì)胞凍存和復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)方法原理：
一、細(xì)胞凍存
1.10%DMSO或甘油冷凍培養(yǎng)基的制備10～20%小牛血清。
2. 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用胰蛋白酶消化，懸液中生長(zhǎng)的細(xì)胞直接移到15 ml離心管。
3. 離心機(jī)轉(zhuǎn)速1000轉(zhuǎn)，5分鐘。
4. 除去胰蛋白酶和舊培養(yǎng)基，加入適量配制好的冷凍培養(yǎng)基。用吸管輕輕吹氣使細(xì)胞均勻、計(jì)數(shù)，調(diào)整凍液中細(xì)胞的最終密度為5×106/ml～1×107/ml。
5. 細(xì)胞分成深低溫保存管，每管1～1.5ml。。
6. 低溫保存管上標(biāo)明細(xì)胞名稱、冷凍時(shí)間和操作人員。。
7. 冷凍：標(biāo)準(zhǔn)的冷凍程序是冷卻速度為—1～—2°C/min。溫度低于—25℃時(shí)，可提高到—5°C~-10°C / min.。在—100℃時(shí)，可快速浸入液氮中。。含有細(xì)胞的冷凍保存管也可以放在—20°C的冰箱里2個(gè)小時(shí)，然后放入—70°D的冰箱中過(guò)夜。取出冷凍管并將其移到液氮容器中。。
三、 細(xì)胞復(fù)蘇
1. 將冷凍管從液氮容器中取出，直接浸入37°C溫水中，并不時(shí)搖晃，使其盡快融化。。
2. 從37°C水浴中取出凍存管，打開(kāi)蓋子，用移液器吸出細(xì)胞懸液，加入離心管滴下培養(yǎng)液10倍以上，攪拌均勻。。
3. 離心，1000轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘。
4. 棄去上清液，加入10%小牛血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
5. 第二天更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。。
注冊(cè)事項(xiàng)：
1. 從增殖期到形成致密單層細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞可用于低溫保存，但優(yōu)選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。冷凍前一天最好換培養(yǎng)基。
2. 將冷凍儲(chǔ)存管放入液氮容器或取出時(shí)，要做好防護(hù)工作，避免凍傷。。
3. 冷凍復(fù)蘇時(shí)，最好使用新配制的培養(yǎng)基。
細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的基本原理是慢凍快解凍，已被證明能最大限度地提高細(xì)胞活力。目前常用甘油或二甲基亞砜作為細(xì)胞低溫保存的保護(hù)劑。這兩種物質(zhì)可以提高細(xì)胞膜對(duì)水的滲透性，再加上緩慢的冷凍可以使細(xì)胞內(nèi)的水從細(xì)胞中滲出，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少冰晶形成對(duì)細(xì)胞的損傷。復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)應(yīng)采用快速熔融的方法，以保證細(xì)胞外晶體在短時(shí)間內(nèi)熔融，以避免因水緩慢熔融進(jìn)入細(xì)胞形成細(xì)胞內(nèi)重結(jié)晶而對(duì)細(xì)胞造成損傷。
實(shí)驗(yàn)步驟：一、細(xì)胞凍存
1.10%DMSO或甘油冷凍培養(yǎng)基的制備10～20%小牛血清。
2. 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用胰蛋白酶消化，懸液中生長(zhǎng)的細(xì)胞直接移到15 ml離心管。
3. 離心機(jī)轉(zhuǎn)速1000轉(zhuǎn)，5分鐘。
4. 除去胰蛋白酶和舊培養(yǎng)基，加入適量配制好的冷凍培養(yǎng)基。用吸管輕輕吹氣使細(xì)胞均勻、計(jì)數(shù)，調(diào)整凍液中細(xì)胞的最終密度為5×106/ml～1×107/ml。
5. 細(xì)胞分成深低溫保存管，每管1～1.5ml。。
6. 低溫保存管上標(biāo)明細(xì)胞名稱、冷凍時(shí)間和操作人員。。
7. 冷凍：標(biāo)準(zhǔn)的冷凍程序是冷卻速度為—1～—2°C/min。溫度低于—25℃時(shí)，可提高到—5°C~-10°C / min.。在—100℃時(shí)，可快速浸入液氮中。。含有細(xì)胞的冷凍保存管也可以放在—20°C的冰箱里2個(gè)小時(shí)，然后放入—70°D的冰箱中過(guò)夜。取出冷凍管并將其移到液氮容器中。。
三、 細(xì)胞復(fù)蘇
1. 將冷凍管從液氮容器中取出，直接浸入37°C溫水中，并不時(shí)搖晃，使其盡快融化。。
2. 從37°C水浴中取出凍存管，打開(kāi)蓋子，用移液器吸出細(xì)胞懸液，加入離心管滴下培養(yǎng)液10倍以上，攪拌均勻。。
3. 離心，1000轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘。
4. 棄去上清液，加入10%小牛血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
5. 第二天更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。。
注冊(cè)事項(xiàng)：
1. 從增殖期到形成致密單層細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞可用于低溫保存，但優(yōu)選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。冷凍前一天最好換培養(yǎng)基。
2. 將冷凍儲(chǔ)存管放入液氮容器或取出時(shí)，要做好防護(hù)工作，避免凍傷。。
3. 冷凍復(fù)蘇時(shí)，最好使用新配制的培養(yǎng)基。
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