多重免疫分析具有許多優點，如可以從每個樣本中獲取更多的生物信息，更高的通量以及（在許多情況下）降低成本。多標實驗還通過在相同的實驗條件下同時測量所有分析物來消除其他變量的影響，例如測定溫度，緩沖液系統和操作員。開發多重免疫測定的主要挑戰是不同分析物的濃度和表達模式可能會有很大差異。這可以通過仔細的實驗設計來解決。

1. 了解樣本信息
為了使多重免疫測定生成可靠的數據，必須對其進行配置以確保準確檢測所討論的每種分析物。分析物的豐度和表達位置可能不同；雖然有些分析物是細胞內的，但其他分析物在細胞表面表達或作為分泌的生物分子表達。在某些情況下，可能需要刺激分析物表達（例如，通過與生長因子一起孵育）或鑒定特定的蛋白質亞型。UniProt和PAXdb等開放獲取資源提供有關蛋白質豐度，已知異構體和翻譯后修飾（PTM）的信息，而出版物和抗體數據表是其他有用的資源。

2. 考慮所需的多路復用級別
多重免疫測定的復雜性范圍很廣，包括靶蛋白的蛋白質印跡檢測和同一膜上的上樣物對照，通過對組織切片中3或4種不同蛋白質的免疫組化（IHC）分析，到基于流式細胞術檢測由單個細胞表達的多達20種不同的分析物。使用基于磁珠的檢測或抗體陣列，可以同時監測數百個生物分子。作為一般規則，對特定分析物的了解越少，所需的多重檢測水平就越高;雖然檢測盡可能多的靶標可能很誘人，但分析物的數量應與每次測試的成本以及測定開發和驗證所涉及的工作量相平衡。

3. 鑒定合適的分析物特異性抗體
分析物特異性抗體是多重免疫測定的關鍵成分，應謹慎選擇。首先，應針對預期應用對其進行驗證，抗體制造商的數據表為抗體性能提供支持證據。同樣重要的是需要滴定抗體以鑒定可接受的信號窗口;這包括分析物特異性抗體和將用于檢測的任何二抗。單克隆抗體具有批次間性能一致和保證長期供應的優勢。然而，由于多克隆可以通過識別幾種表位來提供信號放大，因此它們可以成為檢測稀有分析物的首選。通常的做法是在同一實驗中將單克隆和多克隆抗體組合在一起以進行多重檢測。

4. 選擇兼容的二抗
除非可與酶或熒光團偶聯分析物特異性抗體，否則二抗是實現靶標檢測的必需試劑。重要的是，二抗可以提供信號擴增，這意味著它們通常被納入多重免疫測定工作流程中，以確保檢測低豐度靶標。在選擇二抗試劑時，確認它們與分析物特異性抗體相容至關重要 - 例如，山羊抗兔二級試劑將用于檢測在兔宿主中培養的分析物特異性抗體。 亞類特異性二抗提供了并行使用來自同一宿主物種的幾種抗體的靈活性，前提是它們的特異性已得到制造商的確認，而交叉吸附的二抗（Min X）可最大限度地減少物種交叉反應性，這可能是不需要的背景信號的來源。當其他一抗選項不可用時，也有標記來自同一宿主物種的兩種一抗的策略。 

5. 確定是否需要額外的信號放大
雖然多克隆分析物特異性抗體和二抗試劑都提供信號擴增，但有時可能需要進一步增強測定信號。一種流行的方法是使用標記的鏈霉親和素-生物素（LSAB）信號擴增，即在加入標記的鏈霉親和素進行檢測之前，分析物特異性抗體被生物素化的二抗結合。在這種情況下，信號放大是通過1）多個生物素附著在每個二抗上和2）鏈霉親和素的四聚體性質來實現的，其每個分子具有四個生物素結合位點，增加了親和力。

6.使用在線工具
在大多數情況下，多重免疫測定依賴于熒光讀數（免疫印跡是一個例外，其中化學發光檢測可用于同時可視化具有不同分子量的兩個條帶），并且建議將明亮的熒光團與稀有靶標配對，反之亦然。隨著靶標分析物數量的增加，實驗設計變得越來越具有挑戰性，特別是對于流式細胞術，在同一實驗中可以檢測到多達20種不同的生物分子。 Spectra Viewer等在線工具通過提供熒光團激發和發射光譜的可視化來簡化面板設計，從而快速評估熒光團兼容性。

7. 記得確認批次間的一致性
多重免疫測定涉及使用廣泛的抗體選擇，隨著時間的推移，每種抗體將包含不同的批次。建議研究人員在每次購買新批次時測試抗體性能 - 包括分析物特異性抗體和二抗試劑 - 以確保可重復的結果。對于涉及大量樣品的研究，或那些將在較長時間內進行的研究，直接從制造商處購買（或保留）大量抗體試劑可能是明智的。

8. 始終包括適當的控制
質控品對于任何免疫測定都是必不可少的，它們用于監測測定性能和驗證結果。陽性對照產生最大的測定信號，而陰性對照提供非特異性結合的指示;兩者都應包含在每個免疫測定中，無論檢測到的不同靶標的數量如何。其他類型的對照包括僅二抗對照，旨在評估在沒有分析物特異性抗體的情況下的二抗結合;補償對照，用于通過用單個熒光團染色樣品來評估流式細胞術中的光譜重疊;和同種型對照（包含與分析物特異性抗體具有相同同種型和濃度但不能識別靶標的抗體），用于 IHC 和流式細胞術，以幫助識別背景染色的來源。

9. 考慮整合自動化
自動化通過提高樣品通量和提高實驗一致性來補充多路復用的優勢。它還降低了交叉污染的風險，有助于防止對身體的重復性勞損，并釋放研究人員的時間用于其他任務。自動化選項包括可同時分配96個等分試樣的多通道分配器，IHC染色系統和全自動免疫測定平臺;這些都是值得考慮的，作為簡化多路復用工作流程的策略。

10.使用高品質二抗產品
進行多標記免疫測定可能讓人無從下手，但Jackson ImmunoResearch（一家為生命科學應用提供二抗的專業原始生產商）可以為您提供幫助。JIR公司提供與熒光蛋白（包括 R-PE、APC 和 PerCP）和熒光染料（包括 Alexa Fluor®、亮紫色和羅丹明紅™）偶聯的二抗，以及亞類特異性二抗、交叉吸附二抗、生物素化二抗、并標記鏈霉親和素。