在上一篇推文《細胞外囊泡——下一代藥物遞送平臺》中，小編介紹了細胞外囊泡在藥物遞送領域的優勢及挑戰。今天，小編將介紹外泌體，主要是干細胞外泌體在組織修復和再生中的應用潛能及挑戰。
作為全球的焦點和熱點，干細胞是生命科學的前沿，也是治療重大的難治性疾病的新的技術手段，且干細胞移植被認為是再生醫學中很有潛力的方法之一，目前全球已經有十幾款干細胞產品獲批上市。近期，國際干細胞研究學會（ISSCR）發布了2021年更新版《干細胞研究和臨床轉化指南》，把干細胞的臨床轉化標準化推向了新的高度。國內方面，雖然尚無上市的干細胞治療產品，“干細胞研究與器官修復”已列入“十四五”國家重點研發計劃，國內干細胞領域的標準也在逐步發展和不斷完善中。2021年3月，中國細胞生物學會標準工作委員會發布了6項干細胞領域團體標準，國內干細胞相關的臨床研究的備案審核有了更清晰的依據。
同時我們也清醒地意識到，由于干細胞存在致瘤性、促炎癥和宿主排斥等風險，狹義的干細胞治療的安全性仍然是臨床上面臨的挑戰。目前，有大量研究證明，干細胞來源的外泌體中含有干細胞的生物活性物質，能夠替代干細胞發揮器官及組織損傷修復等重要的生物學功能。盡管長期以來被忽略，但干細胞外泌體的應用在干細胞移植中避免了多種潛在風險，且外泌體具有先天無免疫原性、便于保存和運輸等特點，作為“無細胞的干細胞治療技術”顯示出得天獨厚的優勢，所以許多傳統的干細胞治療開發者們開始轉向干細胞外泌體這一“副產物”來尋求更好的解決方案。除了國家在基金層面的大力支持，干細胞外泌體領域也吸引了越來越多的產業化基金，許多致力于干細胞治療的知名公司和制藥巨頭都瞄準了外泌體這一黃金賽場，紛紛增加外泌體相關的管線，推動該領域的飛速發展。
細胞外囊泡 (EVs) 是一類包載了核酸、蛋白質、脂類等生物活性分子的膜性囊泡，其內含物在一定程度上類似于其來源母細胞，是細胞間信號傳輸的載體。根據分泌途徑的不同，EVs 主要分為外泌體和微囊泡兩大類，由于國內讀者習慣稱呼“外泌體”，故文中不對 EVs 與外泌體做明顯區分。有研究表明，細胞外囊泡的蛋白質和 RNA，可介導靶向細胞間的信號傳遞，甚至遺傳信息的功能性轉移，這一發現極大地促進了細胞外囊泡在再生醫學領域的發展。
 

圖1. 細胞外囊泡示意圖

一、EVs作為再生制劑的潛能

EVs 包含著多種生物大分子如蛋白質、脂質和核酸等，其攜帶的內含物在一定程度上類似于其來源母細胞。EVs 本質是異質性群體，大小不均一，成分復雜，不同組織和細胞之間的活性分子可能會有所不同。幾乎所有的細胞都會分泌 EVs，其中間充質干細胞（MSC）由于其旁分泌機制發揮治療作用成為再生應用中流行的 EVs 細胞源。盡管 MCS 分泌的外泌體是研究中常見的類型，但也存在其他細胞來源如胚胎誘導的多能干細胞，組織特異性干細胞以及初級前體和成熟細胞等分泌的外泌體成功應用于再生治療中。由于 EVs 具有良好的生物相容性以及低免疫原性等優點，EVs 作為潛在的治療制劑在組織修復和再生中獲得了廣泛的關注，越來越多的研究評估了它們對各種器官和組織修復和再生的適用性

1.EVS具有再生潛力
細胞外囊泡作為天然的大分子載體，其再生潛力主要歸因于對免疫調節、細胞遷移、分化、血管生成和組織極性的調節。有多項研究研究表明，EVs 主要通過其攜帶的生物分子在不同組織和器官中誘導再生和治療效果。天然的 EVs 攜帶的表面的膜蛋白或負載蛋白和核酸分子如 mRNA、miRNA等可在結合和細胞內化后激活靶細胞的信號轉導，調節靶細胞的遷移能力、耐藥能力等。如來源于間充質干細胞（Mesenchymal Stem Cell, MSC）的 EVs 通過傳遞 miRNAs 可減少角膜纖維化和炎癥；對MSC-EVs 蛋白質組的研究表明，它們含有可以介導血管生成、凝血、細胞凋亡、炎癥以及組織再生的蛋白質。因此，EVs 攜帶的內含物在再生醫學上具有巨大的應用潛能。

2.干細胞EVS工程化改造
細胞外囊泡作為藥物遞送的載體，有著適應生理環境的優勢。然而天然 EVs 可攜帶的藥物種類和數量有限，這給 EVs 在再生治療的應用帶來了挑戰。目前，通過現有的基因工程技術和手段如共孵育、轉染、電穿孔、超聲處理和原位合成等各種策略實現 EVs 的改造。通過對 EVs 包裹的核酸或膜表面蛋白進行重組、改造、修飾或更新，可以給 EVs 賦予新的功能和作用。
（1）利用干細胞 EVs 作為載體遞送藥物用于疾病治療是目前較為常見的研究類型。上海第六人民醫院 Zhu 等嘗試在胚胎干細胞來源的外泌體內加載紫杉醇（paclitaxel, PTX）用于惡性腦膠質瘤的治療并取得一定的成功。研究中對胚胎干細胞外泌體粒徑、活性、以及藥物的裝載效率等物理生化性質的進行分析。發現，胚胎干細胞來源的外泌體對膠質瘤細胞具有抑制作用。并且通過工程化手段對外泌體進行修飾（修飾 cRGDyK 肽段）使其能夠靶向腫瘤組織，通過納米流式檢測儀直觀的觀察到修飾前后外泌體的粒徑變化。同時在外泌體內部裝載紫杉醇藥物后，可提高外泌體抗膠質瘤的能力，為治療惡性膠質瘤和其他類型腫瘤疾病的研究提供新的思路。下圖是借助納米流式檢測儀 (NanoFCM) 發表的部分研究結果。
 

圖2. 胚胎干細胞外泌體粒徑分布、ESC-EXO活性結果、凋亡情況

（2）牛奶來源的 EVs 比干細胞來源 EVs 更易獲取且成本更低，應用廣泛。如 Chen 等以乳源性 EVs(mEVs) 為模型，基于細胞外囊泡表面修飾，開發了一種通用且溫和的表面功能化方法，證明可以在不破壞 mEVs 結構的前提下，將多種配體固定在其表面。利用 NanoFCM 單顆粒檢測的優勢，揭示了純化前后的偶聯效率以及改性 mEV 的異質性。此外，細胞攝取和細胞毒性實驗表明結合配體的 mEVs 細胞靶向性和貨物輸送能力顯著提高，體內成像實驗進一步證明了轉鐵蛋白偶聯技術在提高mEVs 腫瘤區域富集能力的適用性。總的來說，這種修飾方法能夠實現食品源性細胞外囊泡 (FDEVs) 表面的有效功能化，將有望加速基于 EVs 表面修飾的療法的發展。
 

圖3. mEVs異質性及轉鐵蛋白結合mEVs的偶聯效率分析

EVs 作為藥物載體，可高效向特異損傷的組織器官遞送治療物質，為組織器官再生治療提供了新思路，目前已經累積了許多成功的案例。表1對不同器官系統中 EVs 的治療案例進行了總結。這些案例證實不管是天然的 EVs 還是經過工程化改造的EVs 在再生醫學領域均能帶來更多、更大的驚喜。

表1.目前針對不同系統的EVs再生治療案例

二、EVs在體內分布、安全性及表征技術挑戰
有研究認為 EVs 在體內的生物分布取決于其來源母細胞，EVs表面的分子組成、給藥途徑等亦可顯著影響其生物分布。例如，小鼠體內靜脈注射后優先在肝臟、脾臟、胃腸(GI)道和肺中積累，樹突狀細胞分泌的 EVs 優先被脾臟吸收，而間充質干細胞來源的 EVs 在肝臟和脾臟中積聚。目前脂質納米粒子在體內和體外遞送的有效性和生物相容性已得到廣泛的關注。與脂質納米粒子相比，EVs 作為藥物的載體具有更大載藥能力、調節和靶向特定的組織以及安全性和藥代動力學等方面的優勢。截至目前，鮮有關于 EVs 給藥后副作用的報道，因此，可以認為干細胞 EVs 給藥基本安全。同時，由于 EVs 的大小不均一、成分復雜，在 EVs 的綜合表征和質量保證方面存在局限性，限制了 EVs 臨床轉化的進程。
目前，利用集權平均的方法分析 EVs，可確定大量的 EVs 內含有不同的生物分子。但是 EVs 尺寸微小，異質性大，單個 EVs中攜帶的載物數量存在一定的限制，且不同來源的 EVs 含量也存在顯著差異。細胞外囊泡作為再生制劑，若其中包含過多非功能性成分很可能會降低其治療效果，且治療時常需要使用更高劑量。因此，對囊泡生物分子基于單顆粒水平的分析將比利用集權平均的表征更有助于判斷 EVs 作為治療制劑的療效。并且基于單顆粒水平的分析技術更有望促進 EVs 亞群以及具有生物活性的 EVs 亞群的識別和表征。

三、EVs再生療法的臨床應用與產業化發展
目前，全球范圍內的臨床試驗數據庫中注冊了數十項涉及 EVs的研究,但大多數旨在監測循環 EVs 作為疾病的生物標志物、疾病進展和應用治療的有效性。表2總結了 EVs 用于組織再生修復的案例，臨床試驗多處于I期或II期，目的是為了評估用于治療的 EVs 的安全性和有效性。而 COVID-19 的大流行推進了多項MSC 衍生的 EVs 臨床試驗的啟動，旨在減輕患者在感染 SARS-CoV-2 病毒后的并發癥。這些試驗的結果無疑將有助于進一步了解 EVs 在免疫調節中的臨床價值。同時，也有不少公司積極投入到EVs的治療產品的開發中，其中 Capricor Therapeutics、Aegle Therapeutics、United Therapeutics和Exopharm等公司利用 EVs 作為組織修復的生物治療制劑進行臨床試驗，余下的大部分公司預計未來幾年將會陸續進行人體研究。此外，利用細胞外囊泡的再生特性生產的產品在化妝品和護膚領域的應用中也受到了持續且廣泛的關注。
由于 EVs 療法的創新性，其臨床分級、生產質控以及在應用上缺乏世界公認的標準。因此，EVs 產業化發展還需克服以下幾個方面的限制：

（1）建立適用于臨床大規模制備、純化和儲存的分離方案；
（2）EV的量化、分子和物理表征的標準化方法；
（3）明確臨床使用的質量控制標準等。

表2. 臨床中應用于組織修復和再生的EVs制劑

四、總結與展望
細胞 EVs 作為一種嶄新的治療方法具有在組織損傷修復及再生的應用及其他疾病治療的治療潛力。體內和體外研究認為，EVs 通過促進細胞增殖、分化和血管生成以及抑制細胞凋亡和炎癥來介導組織修復。但是由于缺乏有效的表征技術以及標準化的分離方法，EVs 是如何促進組織再生以及是什么驅動它們再生作用的機制仍遠未闡明。此外，由于其復雜的藥代動力學，需要進一步的去探索其作為治療制劑在再生效應中發揮作用的機理。因此，在單顆粒水平對 EVs 進行表征分析，并剖析不同EVs亞群的特定內含物，及其特定的生物學作用，將有助于更好地定義用于組織修復和再生的 EVs 制劑的作用機制。
作為一款“為外泌體為生”的檢測設備，納米流式檢測儀(NanoFCM)可在單顆粒水平對 40-1000 nm 的 EVs 進行單顆粒分析，具有與電鏡結果相媲美的分辨率。NanoFCM 還是一款省時，省樣品又省力的檢測儀器。對于樣品的實際消耗只需0.1 μL ，1min即可實現樣品檢測，一步檢出粒徑分布、顆粒濃度以及陽性表達率等。
總的來說，不僅可對 EVs 的顆粒濃度、粒徑分布、載藥量、蛋白、核酸等物理生化性質進行分析，還對 EVs 的生產過程進行質量控制，優化生產條件、提高載藥效率。同時可對 EVs 在生產后的穩定性進行評價，評估不同存儲條件對 EVs 的影響。NanoFCM 的應用貫穿整個 EVs 制劑研發、大規模生產、分離純化、質控、穩定性評估等整個過程，極大加速 EVs 產品研發和產業化進程！

參考文獻：

• 1. An A , Mo B , Lvdk C , et al. Extracellular vesicles for tissue repair and regeneration: evidence, challenges and opportunities[J].Advanced Drug Delivery Reviews, 2021.
• 2. Gurunathan S, Kang MH, Jeyaraj M, Qasim M, Kim JH. Correction: Gurunathan, S. et al. Review of the Isolation, Characterization, Biological Function, and Multifarious Therapeutic Approaches of Exosomes[J]. Cells2019, 8, 307. Cells. 2021.
• 3. Zhu Q , X Ling, Yang Y , et al. Embryonic Stem Cells‐Derived Exosomes Endowed with Targeting Properties as Chemotherapeutics Delivery Vehicles for Glioblastoma Therapy[J]. Advanced Science, 2019.
• 4. Chen C , Sun M , Liu X , et al. General and Mild Modification of Food-derived Extracellular Vesicles for Enhanced Cell Targeting[J]. Nanoscale, 2021.
• 5. 王前,鄭磊《細胞外囊泡—基礎研究與臨床應用》[M].科學出版社.2019.