三代全長16S/18S/ITS擴(kuò)增子測序的介紹

瀏覽次數(shù)：2339　發(fā)布日期：2022-2-18　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

三代微生物多樣性是基于PacBio SequelⅡ測序平臺，利用單分子實(shí)時測序的方法，對原核生物16S的全部V1-V9可變區(qū)域或真核生物的18S高變區(qū)域或ITS區(qū)域進(jìn)行全長擴(kuò)增，不僅能提高物種鑒定的分辨率，還能提高樣本中微生物組成鑒定的精確度，從而更全面的反應(yīng)微生物的群落結(jié)構(gòu)。

一、PacBio測序原理
利用與二代測序相同的邊合成邊測序的原理，以SMRT芯片為載體；模板與特殊聚合酶結(jié)合后，4種不同熒光標(biāo)記的脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）通過布朗運(yùn)動隨機(jī)進(jìn)入檢測區(qū)與聚合酶結(jié)合，按DNA模板序列延伸；通過檢測單個DNA分子的合成所產(chǎn)生的信號來進(jìn)行測序，也可通過檢測相鄰兩個堿基的測序時間，來檢測一些堿基修飾情況。

圖1. PacBio測序原理^[1]

二、產(chǎn)品優(yōu)勢
于二代測序只能獲取1~2個高變區(qū)短讀長序列而言，三代測序能一次性測到所有高變區(qū)，同時也可以避免不同引物帶來的偏好性，從而提高微生物群落的分類學(xué)分辨率。
1.更長讀長，更高準(zhǔn)確率^[2]

圖2. 測序長度和準(zhǔn)確度

2.更高的物種鑒定分辨率和精確度^[3]

圖3. 物種鑒定結(jié)果

3.更準(zhǔn)確的還原微生物群落^[4]

圖4. 微生物群落分布

三、技術(shù)路線

圖5. 技術(shù)流程圖

四、案例分享
文章標(biāo)題：三代全長微生物多樣性研究母嬰微生物群^[5]
研究小結(jié)：早期微生物與成年后疾病的發(fā)生發(fā)展有一定的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)子宮、胎便、羊水和胎盤都有微生物存在，那么嬰兒胎便微生物來源與母體不同來源的樣本的關(guān)系如何呢？本文以39對母嬰的產(chǎn)婦樣本（羊水、糞便、陰道分泌物和唾液）和嬰兒胎便樣品為研究對象，基于PacBio三代全長測序技術(shù)進(jìn)行16S rRNA檢測。檢測發(fā)現(xiàn)不同類型樣本間α多樣性和β多樣性存在特異性；同時除發(fā)現(xiàn)不同類型樣本各自的一些優(yōu)勢菌（其中羊水和陰道分泌物的優(yōu)勢菌為Lactobacillus和Curvibacter，胎便的優(yōu)勢菌為Bacillus 和Escherichia/Shigella，產(chǎn)婦糞便的優(yōu)勢菌為Bacteroides和Faecalibacterium，產(chǎn)婦唾液的優(yōu)勢菌為Streptococcus和Prevotella）外，還發(fā)現(xiàn)了他們間共有OTUs，其中胎便菌群與羊水菌群的共有OTUs多于產(chǎn)婦糞便菌群和陰道菌群，由此推斷羊水菌群相比其他位點(diǎn)貢獻(xiàn)更大。此外，發(fā)現(xiàn)剖腹產(chǎn)和順產(chǎn)胎兒的胎便和羊水微生物群落結(jié)構(gòu)無顯著差異。