外泌體的神秘面紗已經(jīng)全面揭開，研究熱潮席卷而來。從上游到下游的外泌體相關(guān)產(chǎn)品與服務(wù)的公司遍地開花，各類國家課題基金申請的外泌體相關(guān)中標數(shù)量逐年升高，想要從“大蛋糕”里分走一塊嘗嘗鮮，需要把握外泌體的整體研究思路，并針對研究樣本和目的設(shè)計合理的外泌體研究方案。2021年接近尾聲，小希給各位全方位的理一理外泌體研究的思路，蹭一蹭外泌體的熱度過個冬！
 

圖1 外泌體研究整體思路

 

外泌體——基礎(chǔ)知識篇

 

細胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）是指細胞主動分泌的具有膜結(jié)構(gòu)的微小囊泡的統(tǒng)稱，幾乎所有的細胞都會分泌EVs，然而EVs最初被認為是細胞向外排泄的“垃圾”，是細胞移除碎片和清除特定大分子的一種途徑。根據(jù)大小、生物特性和形成過程的不同，EVs主要分為外泌體（exosomes）、微囊泡（microvesicles）、和凋亡小體（apoptotic bodies）三大類。近十年來，研究學者重新認識了EVs的重要性，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)EVs可以作為遺傳信息的傳遞者，攜帶和傳遞信號分子運輸?shù)较噜忂h處的細胞，從而調(diào)節(jié)細胞的生理和病理的狀態(tài)，參與許多疾病的發(fā)生發(fā)展過程，其中對于外泌體的研究最為火熱。

 

一、外泌體的樣本來源

由于研究細胞分泌的外泌體，需要避免培養(yǎng)基中其它外源性外泌體對細胞分泌外泌體的影響，目前采用以下方法獲取研究樣本：血清饑餓培養(yǎng)、去外泌體血清培養(yǎng)、無血清體系培養(yǎng)、其它樣本來源。

 

01 血清饑餓培養(yǎng)

一般是指通過降低培養(yǎng)液中的血清濃度，使所培養(yǎng)的細胞因缺乏血清中的生長因子而不能分裂，這個操作常用來做細胞同步化分裂。常規(guī)操作就是在細胞培養(yǎng)至融合度為50-60%左右，撤去含血清的完全培養(yǎng)基，更換為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進行饑餓培養(yǎng)細胞至融合度為80%左右，收獲細胞上清進行下游的研究。但血清饑餓培養(yǎng)收獲的外泌體量有限且質(zhì)量較低。

 

02 去外泌體血清培養(yǎng)

為了減少或避免血清饑餓培養(yǎng)對細胞分泌外泌體的影響，去外泌體血清培養(yǎng)細胞成為大多數(shù)學者選擇的一種方式。去外泌體血清可適用于大部分細胞培養(yǎng)，基本可維持與正常胎牛血清中相同生長速率和形態(tài)。在使用各種方法去除胎牛血清中大部分的外泌體后添加至培養(yǎng)基中配制成去外泌體血清完全培養(yǎng)基，應(yīng)用于細胞外泌體的研究。

 

03  無血清體系培養(yǎng)

 

從饑餓培養(yǎng)到去外泌體血清培養(yǎng)，再到無血清體系培養(yǎng)。這是針對外泌體研究所做出的培養(yǎng)基改善與優(yōu)化。也讓學者們能夠了解到細胞培養(yǎng)所需要的營養(yǎng)成分。目前無血清體系的培養(yǎng)基可分為含血小板裂解物（含外泌體）的無血清培養(yǎng)基、配方明確的無血清培養(yǎng)基等，其中配方明確的無血清體系讓研究細胞外泌體的結(jié)果更加準確。

 

 

 

除了細胞來源的外泌體樣本研究最為廣泛，血漿、血清也是多數(shù)學者的研究樣本，其它的樣本包括唾液、腦脊液、乳汁、尿液等生物體液，均可以作為外泌體研究的樣本來源。

 

二、外泌體的富集

 

目前采用2D培養(yǎng)方式收獲大量細胞上清的學者占多數(shù)。這種方式收獲的細胞上清中顆粒濃度低，樣本體積大，后續(xù)的純化成本、人力、物力消耗大。但對于基礎(chǔ)研究，基本2D培養(yǎng)方式獲得的外泌體樣本量就可以滿足。另外需要考慮的是不同細胞培養(yǎng)方式可以刺激細胞產(chǎn)生不同表征或內(nèi)含物的外泌體。所以3D培養(yǎng)方式通過模擬體內(nèi)環(huán)境讓細胞更好地伸展，正確表達或分泌的外泌體量較2D培養(yǎng)方式要更多。各類的生物反應(yīng)器（例如FiberCell系統(tǒng)等）或細胞外基質(zhì)涌現(xiàn)在大眾面前，可根據(jù)實際研究需要選擇合適的設(shè)備或試劑進行外泌體的富集。

 

 

三、外泌體的提取/純化

 

作為新興研究領(lǐng)域，外泌體研究的技術(shù)方法正在走向標準化。國際細胞外囊泡學會（ISEV）分別在2014年和2018年發(fā)表了EVs的研究方法與質(zhì)控標準。但如何獲得高質(zhì)量的外泌體樣本一直是外泌體相關(guān)基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的瓶頸問題之一。目前已經(jīng)報道的外泌體提取/純化的方法包括：超速離心法、超濾法、尺寸排阻色譜法、沉淀法、免疫親和分離法（免疫磁珠法、微流控技術(shù)）等。不同提取方法獲得的外泌體質(zhì)量不一，且結(jié)果可能不可重復(fù)。總之，沒有單一的提取方法適合所有外泌體的研究目的，組合的外泌體提取/純化方法逐漸成為一種趨勢。正確獲得高質(zhì)量的外泌體，提高實驗研究的準確性和可靠性。可根據(jù)實驗研究樣本類型與體積選擇合適的提取方法獲取高質(zhì)量的外泌體樣本。

圖2 尺寸排阻色譜法原理示意圖

 

四、外泌體的特征鑒定

 

根據(jù)ISEV在2014年發(fā)表的指導(dǎo)手冊（MISEV），對于獲得的外泌體樣本需要做以下鑒定：

• 納米顆粒示蹤分析（NTA）：觀察樣本中外泌體的粒徑和濃度情況；

• 透射電鏡（TEM）：觀察外泌體的形態(tài)特征；

• 蛋白免疫印跡實驗（WB）：鑒定外泌體的表面標志蛋白表達情況。

圖3  NTA檢測結(jié)果（左一），TEM檢測結(jié)果（中），WB檢測結(jié)果（右一）

 

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五、外泌體的下游分析

 

經(jīng)過上面的檢測可對外泌體驗明正身，就可以在蛋白水平和核酸水平對其進行深入分析。外泌體攜帶大量功能性的miRNA、少量mRNA、IncRNA，以及特異性的蛋白質(zhì)（例如細胞因子、生長因子）等生物活性物質(zhì)，用于參與細胞之間通訊、細胞遷移、參與各種疾病的過程等。不同細胞來源的外泌體所含的蛋白成分和RNA不太相同，可作為多種疾病的早期診斷標記物，也能作為靶向藥物的載體進行疾病治療。

 

目前外泌體的下游分析包括：

• 外泌體高通量測序：研究方向為表達譜、分子標志物、分子機制等。包括miRNA測序、mRNA測序、IncRNA測序、cicRNA測序。

   

圖4 外泌體高通量測序-差異分析圖

 

• 外泌體蛋白組學分析：研究方向為疾病發(fā)病機制、疾病診斷和預(yù)后的生物標志物、篩選疾病治療靶點等。包括定性技術(shù)（Shotgun）、定量技術(shù)（TMT/iTRAQ/Label Free/DIA）、修飾技術(shù)（磷酸化、糖基化、乙酸化、泛素化）。

圖5 外泌體蛋白組學分析-韋恩圖

 

 

• 外泌體標記/示蹤：研究方向為外泌體的體內(nèi)生物分布、生理功能、遷移和靶向機制等。包括磁成像示蹤（MRI）、計算機斷層掃描示蹤（CT）、核成像示蹤、光聲成像示蹤、熒光成像示蹤（親脂性染料標記、慢病毒標記）、生物發(fā)光成像示蹤（BLI，熒光素酶-底物反應(yīng)）。

• 外泌體功能鑒定：研究方向為外泌體參與細胞共培養(yǎng)、細胞遷移與侵襲、細胞凋亡等，以及動物體內(nèi)注射后表型變化和其它指標檢測。

• 外泌體臨床研究：研究方向為藥物遞送載體、早期臨床診斷、各類疾病治療、醫(yī)美領(lǐng)域等。

 

 

外泌體研究除了必備的“硬件”操作技術(shù)與檢測設(shè)備，同樣具有“軟件”的數(shù)據(jù)庫知識供全球外泌體研究學者參考。今天就給大家列舉8大外泌體數(shù)據(jù)庫，為您的外泌體研究增添靈感。

01  ExoCarta——外泌體蛋白質(zhì)、RNA和脂質(zhì)數(shù)據(jù)庫

ExoCarta是首個外泌體標志物綜合數(shù)據(jù)庫，由Simpson教授團隊建立，具有外泌體蛋白動態(tài)的蛋白與蛋白之間相互關(guān)系網(wǎng)及生物學通路。用戶可從大量研究中下載最常用的蛋白數(shù)據(jù)。

 

02 exoRBase——人體液外泌體長鏈RNA-Seq數(shù)據(jù)庫

exoRBase數(shù)據(jù)庫收集和描述人類體液中所有長鏈RNA，目前包含19643 個mRNA、15645個IncRNA和79084個cicrRNA，提供注釋、表達水平和可能的來源組織。

 

03 EVmiRNA——miRNA數(shù)據(jù)庫

一種EVs的miRNA數(shù)據(jù)庫，收錄了17種器官或疾病的462個sRNA測序數(shù)據(jù)集，包括miRNA表達譜、miRNA調(diào)節(jié)途徑、miRNA函數(shù)、miRNA相關(guān)藥物及相關(guān)文獻，為EVs的miRNA研究提供重要資源。

 

04 EVpedia——外泌體蛋白質(zhì)組、轉(zhuǎn)錄組和脂質(zhì)體數(shù)據(jù)庫

EVpedia是由韓國項浦大學創(chuàng)建的一個完整而全面的蛋白質(zhì)組、轉(zhuǎn)錄組和脂質(zhì)體數(shù)據(jù)庫，其來源包括原核和真核生物。這個免費的數(shù)據(jù)庫可以作為EVs研究進展的一個基本資料庫，有助于闡明EVs的新功能。

 

05 Vesiclepedia——外泌體蛋白質(zhì)、RNA和脂質(zhì)數(shù)據(jù)庫

Vesiclepedia數(shù)據(jù)庫是公開的，允許用戶根據(jù)不同的搜索標準查詢和下載EV cargo、EV分離和表征模式，生物物理和分子特性以及EV-METRIC，幫助生物醫(yī)學科學家評估EV制劑的質(zhì)量，獲得相應(yīng)的數(shù)據(jù)。

 

06  EMBL-EBI——外泌體蛋白GO功能分析數(shù)據(jù)庫

EMBL-EBI即為歐洲生物信息學研究所，擁有世界上最全面的免費和最新的分子數(shù)據(jù)資源。該數(shù)據(jù)庫與ExoCarta和Vesiclepedia緊密合作，識別用于聚焦注釋的靶蛋白以及外泌體實驗方法學的注釋。

 

07 EV-TRACK——外泌體相關(guān)文獻數(shù)據(jù)庫

EV-TRACK是以大牛Thery為首的EV-TRACK聯(lián)盟建立的EVs研究透明報告在線數(shù)據(jù)庫，其中包括EVs相關(guān)文獻的方法學參數(shù)，基于MISEV評估EVs分離及鑒定相關(guān)參數(shù)。便于提高外泌體實驗研究的規(guī)范性和結(jié)果的可靠性。

 

08 Urinary Exosome Protein Database——尿液外泌體蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫

這個尿液外泌體蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫是基于上皮系統(tǒng)生物實驗室（ESBL）已發(fā)表的蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)建立的數(shù)據(jù)庫。所有數(shù)據(jù)均來源于健康志愿者的尿液外泌體，這個數(shù)據(jù)庫包含了用兩種不同的質(zhì)譜儀來鑒定人類尿液外泌體的蛋白質(zhì)。

外泌體——參考文獻篇

對于科研工作者來說，想要快速get某個領(lǐng)域的基礎(chǔ)或關(guān)鍵信息，莫過于閱讀該領(lǐng)域最權(quán)威、最全面的文獻綜述了。外泌體的重要性決定了它可以在很多研究領(lǐng)域站住腳，文章就是最直接的體現(xiàn)。小希為外泌體研究工作者整理了8篇必讀文獻和不同研究領(lǐng)域內(nèi)可接收外泌體相關(guān)研究發(fā)表的雜志，讓您充分地了解到外泌體就在身邊，就在眼前。

• “Exosomes: composition, biogenesis and function.” 【Nat Rev Immunol】

 

上榜理由：這篇文獻是外泌體領(lǐng)域大牛Thery發(fā)表的最早、較為全面的外泌體綜述。描述了外泌體的物理性質(zhì)，總結(jié)了外泌體的生物學效應(yīng)及其作用。

 

• “Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.” 【J Cell Biol】

   

上榜理由：這篇文獻作者是Raposo，同樣是外泌體領(lǐng)域大牛。相對較早、較全面的闡述了EVs的特性和形成過程極其功能的相關(guān)機制。

 

• “lsolation and charaterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.” 【Current Protocols in Cell Biology】

 

上榜理由：這是大牛Thery的另一篇關(guān)于外泌體分離提取鑒定的最原始、最權(quán)威的文獻。詳細描述了不同樣本來源的外泌體分離提取方法，且對外泌體制劑進行評價。

 

• “Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.”【Annu Rev Cell Dev Biol】

 

上榜理由：這是Thery和Raposo兩位大牛的合作。詳細闡述了外泌體的生物發(fā)生、分泌及其后續(xù)的功能等。配圖非常值得保存學習！

 

• “Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.” 【J Extracellular Vesicles】

 

上榜理由：本文作者由來自57個不同工作單位的61位大佬組成，參考的文獻數(shù)量為175篇，文章內(nèi)容全面。綜合描述了各種組織和體液中EVs的內(nèi)含物和功能，以及不同生物與植物中EVs的生理機制。值得大家下載打印出來細讀。

 

• “Exosomes：Vesicles of Intercellular Signaling, Biomarkers, and Vectors of Cell Therapy.” 【Annu Rev Physiol】

 

上榜理由：外泌體不僅內(nèi)含物豐富，同樣可以作為載體運輸大量的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等，進而改變細胞和器官的功能。本文著重于介紹外泌體作為干細胞治療載體的潛力。

 

• “New Technologies for Analysis of Extracellular Vesicles.” 【Chemical reviews】

 

上榜理由：這篇雜志的影響因子高達47.928分，更是全面總結(jié)了細胞外囊泡的研究方法及其臨床應(yīng)用，參考文獻近300篇，各種配圖十分詳細。又是一篇值得打印出來細讀的文獻。

 

• “Communication by Extracellular Vesicles: Where We Are and Where We Need to Go.” 【Cell】

 

上榜理由：看到Cell，文章必然厲害，再看作者又是大牛Thery，必須細品。本文主要關(guān)注外泌體與腫瘤細胞的微環(huán)境之間的關(guān)系，這層關(guān)系同樣適用于EVs介導(dǎo)的其它生理過程。

 

 

以上大牛們的文獻是否能夠滿足您對外泌體的基礎(chǔ)了解呢？是否已經(jīng)摩拳擦掌準備做實驗發(fā)表文章了？

 

 

結(jié)語

外泌體，一個新型的研究熱點，已然成為生命科學領(lǐng)域的“寵兒”。在精準醫(yī)學與疾病診斷治療的進程中，外泌體將釋放無窮無盡的力量。

這一年，我們依然口罩蔽體；這一年，我們依靠磅礴力量；這一年，我們依舊風雨兼程為生活。

下一年，我們?nèi)詴�戴好口罩；下一年，我們�(nèi)耘f砥礪前行；下一年，我們?nèi)砸獢]起袖子加油干。

 

 

參考文獻

 

• Kalluri R, LeBleu VS. The biology, function, and biomedical applications of exosomes[J]. Science. 2020, 367(6478): eaau6977.

• Stam J, Bartel S, Bischoff R, et al. Isolation of extracellular vesicles with combined enrichment methods. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2021, 1169: 122604.

• Gobin J, Muradia G, Mehic J, et al. Hollow-fiber bioreactor production of extracellular vesicles from human bone marrow mesenchymal stromal cells yields nanovesicles that mirrors the immuno-modulatory antigenic signature of the producer cell. Stem Cell Res Ther. 2021, 12(1): 127.