化合物在高通量篩選中的作用
在 1985 年之前，先導物的篩選主要是通過人工進行的，每周處理的樣本數量不過幾百個，組合化學的出現使得科學家們獲取化合物的方式發生了顯著變化，他們可以在短時間內合成大量化合物。
更重要的是，隨著分子生物學和功能基因組的研究發展，使得新穎靶標大量增加，這種情況下，緩慢的人工篩選已經沒有辦法滿足新藥研發的要求，高通量篩選技術的出現大大縮短了先導物開發在藥物發現中的時間。如今，一個普通的藥學高通量篩選實驗室每天篩選的靶標已經超過 10 萬個。
HTS 可根據待測樣品的種類大致分為細胞水平篩選和分子水平篩選兩類。細胞水平篩選是在細胞個體水平上完成的檢測，由于含有諸如信號傳導、物質代謝等關于細胞生命活動的信息，因此可以省去體外篩選中的許多步驟。
下面將圍繞細胞水平篩選介紹幾種常用的檢測方法：離子通道檢測、報告基因檢測和細胞增殖檢測
離子通道是目前藥物發現的重要靶點。例如在心血管疾病中，離子通道檢測可以應用于原發性電障礙 (長 QT 綜合癥、短 QT 綜合癥、Brugada 綜合癥) 等方面的藥物篩選。
以 Novel KCNQ2 channel activators discovered using fluorescence-based and automated patch-clamp-based high-throughput screening techniques 一文為例，通過一種改進的高通量篩選技術，篩選新型 KCNQ2 通道激活劑。
在這篇文獻中，作者團隊以 ZTZ240 (KCNQ2 通道激活劑) 作為陽性對照，通過鉈通量測定法從 80000 種化合物篩選出了 565 個比 ZTZ240 更強活性的化合物。然后使用 384 孔自動化膜片鉗，進一步篩選出了 38 個 KCNQ2 通道激活劑。最后，使用傳統的膜片鉗表征激活劑，得到 ZG1732 和 ZG2083 (EC50 分別為 1.04 μM 和 1.37 μM)。
流程：穩定表達 KCNQ2 通道的 CHO 細胞 → 與染料緩沖液共培養 → 在細胞板中加入不同的化合物孵育 → 鉈通量分析初步篩選 → 384 孔全自動膜片鉗系統進行撞擊驗證 → 自動化膜片鉗二次篩選。
以 Pharmacological enhancement of KCC2 gene expression exerts therapeutic effects on human Rett syndrome neurons and Mecp2 mutant mice 一文為例，作者團隊通過開發建立了一種應用于神經元的高通量篩選方法。該文獻中，結合使用了 CRISPR-Cas9 技術，將熒光素酶報告基因插入人 ES 細胞的內源 KCC2 基因位點中，通過檢測熒光來篩選特異性增強 KCC2 達的化合物，最終從 900 種化合物中篩選出 14 個 KEECs。
流程：培養人類胚胎干細胞 (ES 細胞) 結合 CRISPR-Cas9 技術 → 將熒光素酶報告基因插入人 ES 細胞的內源 KCC2 基因位點 → 高通量篩選出能增強 KCC2 表達的小分子 → 6 次重復篩選從 900 個化合物庫中篩選出 14 個起作用的小分子 → 通過 Western blot 和 RT-PCR 進行比對驗證。
細胞增殖檢測根據檢測內容可以分為四類：ATP 濃度檢測、DNA 合成檢測、代謝活性檢測和細胞增殖相關抗原檢測。與細胞增殖檢測結合的高通量篩選常用于鑒定能殺死各種癌細胞或病原體的化合物，還可以應用于細胞缺陷疾病的藥物篩選。
以 Head and Neck Cancer Stem Cell-Enriched Spheroid Model for Anticancer Compound Screening 為例，作者團隊開發了一種程序簡單，培養時間短的干細胞富集球形模型 (SCESM)，適用于抗癌癥干細胞化合物的新高通量篩選方法 (HTSs)。
流程：特定細胞培養 7 天 → 含不同實驗化合物的處理培養基替代掉一半莖培養液，處理 5 天 → 用 0.5% triton X-100 (Sigma-Aldrich) 在 4℃ 過夜培養 → 用 7-AAD 和 Ki67 共染細胞 → 共聚焦顯微鏡捕獲熒光信號 → 用 qPCR，Flow cytometry，Western blot 驗證檢測結果。
高通量篩選的實驗方法必須具備條件穩定，樣本之間差異性小，容易檢測，且可以大批量同時檢測等特性。除了以上介紹的三種較為常用的方法之外，第二信使檢測、細胞活力檢測等方法也是常用的細胞水平的檢測手段。
化合物庫的使用在篩選前期也起著十分重要的作用。在化合物未知的情況下，數量足夠大的化合物庫可增加識別目標的概率；不同細分用途的化合物庫，則能進一步整合具有某項作用的盡可能多的化合物。
MCE 對不同方向、不同種類、性質不同的化合物做了詳細分類，如生物活性化合物庫、FDA 上市庫、天然產物庫等可以供不同需求的科學家選擇。
隨著技術的發展，MCE 化合物庫數量會越來越多，分類也越來越精細，這將大大節約前期篩選合適化合物所需的時間。此外，MCE 還可以根據你的不同需求提供定制庫~
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參考文獻
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更重要的是，隨著分子生物學和功能基因組的研究發展，使得新穎靶標大量增加，這種情況下，緩慢的人工篩選已經沒有辦法滿足新藥研發的要求，高通量篩選技術的出現大大縮短了先導物開發在藥物發現中的時間。如今，一個普通的藥學高通量篩選實驗室每天篩選的靶標已經超過 10 萬個。
高通量篩選技術
高通量篩選 (High throughput screening，HTS) 技術包括機器人技術、液體處理器、數據處理、相當多的軟件和敏感的檢測系統。它是一種藥物發現過程，可以使生化或細胞事件能夠重復和快速測試化合物數十萬次。HTS 可根據待測樣品的種類大致分為細胞水平篩選和分子水平篩選兩類。細胞水平篩選是在細胞個體水平上完成的檢測，由于含有諸如信號傳導、物質代謝等關于細胞生命活動的信息，因此可以省去體外篩選中的許多步驟。
下面將圍繞細胞水平篩選介紹幾種常用的檢測方法：離子通道檢測、報告基因檢測和細胞增殖檢測
離子通道檢測
離子通道是目前藥物發現的重要靶點。例如在心血管疾病中，離子通道檢測可以應用于原發性電障礙 (長 QT 綜合癥、短 QT 綜合癥、Brugada 綜合癥) 等方面的藥物篩選。
以 Novel KCNQ2 channel activators discovered using fluorescence-based and automated patch-clamp-based high-throughput screening techniques 一文為例，通過一種改進的高通量篩選技術，篩選新型 KCNQ2 通道激活劑。
在這篇文獻中，作者團隊以 ZTZ240 (KCNQ2 通道激活劑) 作為陽性對照，通過鉈通量測定法從 80000 種化合物篩選出了 565 個比 ZTZ240 更強活性的化合物。然后使用 384 孔自動化膜片鉗，進一步篩選出了 38 個 KCNQ2 通道激活劑。最后，使用傳統的膜片鉗表征激活劑，得到 ZG1732 和 ZG2083 (EC50 分別為 1.04 μM 和 1.37 μM)。
流程：穩定表達 KCNQ2 通道的 CHO 細胞 → 與染料緩沖液共培養 → 在細胞板中加入不同的化合物孵育 → 鉈通量分析初步篩選 → 384 孔全自動膜片鉗系統進行撞擊驗證 → 自動化膜片鉗二次篩選。
圖 2. KCNQ2 通道激活劑的篩類[5]
報告基因檢測
報告基因是一種編碼可被檢測蛋白質或酶的基因，其表達產物非常容易被鑒定。基于報告基因的高通量檢測方法在 Rett 綜合征、阿爾茲海默癥等其他腦部疾病的治療上是一個很好的檢測方向，另外還可以通過構建報告病毒的方式篩選抗病毒藥物。以 Pharmacological enhancement of KCC2 gene expression exerts therapeutic effects on human Rett syndrome neurons and Mecp2 mutant mice 一文為例，作者團隊通過開發建立了一種應用于神經元的高通量篩選方法。該文獻中，結合使用了 CRISPR-Cas9 技術，將熒光素酶報告基因插入人 ES 細胞的內源 KCC2 基因位點中，通過檢測熒光來篩選特異性增強 KCC2 達的化合物，最終從 900 種化合物中篩選出 14 個 KEECs。
流程：培養人類胚胎干細胞 (ES 細胞) 結合 CRISPR-Cas9 技術 → 將熒光素酶報告基因插入人 ES 細胞的內源 KCC2 基因位點 → 高通量篩選出能增強 KCC2 表達的小分子 → 6 次重復篩選從 900 個化合物庫中篩選出 14 個起作用的小分子 → 通過 Western blot 和 RT-PCR 進行比對驗證。
圖 3. KEECs 的篩選[6]
細胞增殖檢測
細胞增殖檢測根據檢測內容可以分為四類：ATP 濃度檢測、DNA 合成檢測、代謝活性檢測和細胞增殖相關抗原檢測。與細胞增殖檢測結合的高通量篩選常用于鑒定能殺死各種癌細胞或病原體的化合物，還可以應用于細胞缺陷疾病的藥物篩選。
以 Head and Neck Cancer Stem Cell-Enriched Spheroid Model for Anticancer Compound Screening 為例，作者團隊開發了一種程序簡單，培養時間短的干細胞富集球形模型 (SCESM)，適用于抗癌癥干細胞化合物的新高通量篩選方法 (HTSs)。
流程：特定細胞培養 7 天 → 含不同實驗化合物的處理培養基替代掉一半莖培養液，處理 5 天 → 用 0.5% triton X-100 (Sigma-Aldrich) 在 4℃ 過夜培養 → 用 7-AAD 和 Ki67 共染細胞 → 共聚焦顯微鏡捕獲熒光信號 → 用 qPCR，Flow cytometry，Western blot 驗證檢測結果。
圖 4. 抗癌癥干細胞化合物篩選[10]
高通量篩選的實驗方法必須具備條件穩定，樣本之間差異性小，容易檢測，且可以大批量同時檢測等特性。除了以上介紹的三種較為常用的方法之外，第二信使檢測、細胞活力檢測等方法也是常用的細胞水平的檢測手段。
化合物庫的使用在篩選前期也起著十分重要的作用。在化合物未知的情況下，數量足夠大的化合物庫可增加識別目標的概率；不同細分用途的化合物庫，則能進一步整合具有某項作用的盡可能多的化合物。
MCE 對不同方向、不同種類、性質不同的化合物做了詳細分類，如生物活性化合物庫、FDA 上市庫、天然產物庫等可以供不同需求的科學家選擇。
隨著技術的發展，MCE 化合物庫數量會越來越多，分類也越來越精細，這將大大節約前期篩選合適化合物所需的時間。此外，MCE 還可以根據你的不同需求提供定制庫~
圖 5. 化合物庫定制流程
| 相關產品 |
| 膜轉運蛋白/離子通道化合物庫 MCE 收錄的 800+ 小分子調節劑可用于離子通道和膜轉運體的研究，或相關藥物的高通量篩選。 |
| 抗阿爾茨海默病化合物庫 MCE 收錄了 600+ 種具有抗阿爾茲海默病活性的化合物及靶向阿爾茲海默病主要靶點的化合物。MCE 抗阿爾茲海默病化合物是研究阿爾茲海默病發病機制及開發抗阿爾茲海默病藥物的有用工具。 |
| 生物活性化合物庫 MCE 收錄了 11,000+ 種具有明確報道的、活性已知、靶點明確的小分子化合物，包括天然產物，新型化合物，已上市化合物及處于臨床期化合物等，可以用于信號通路研究，新藥研發，老藥新用等不同的篩選目的。 |
| FDA 上市庫 MCE 收錄了 2,300+ 個批準上市的化合物，這些化合物已經完成了廣泛的臨床前和臨床研究，具有良好的生物活性、安全性和生物利用度。 |
| 天然產物庫 MCE 收錄了 2,800+ 種天然產物，包括糖類和糖苷，苯丙素類，醌類，黃酮類，萜類，類固醇，生物堿，酚類，酸和醛等，天然產物化合物庫是一種有用的藥物開發工具。 |
參考文獻
1. J P Hughes. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 2011 Mar; 162(6):1239-49.
2. S A Sundberg. High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution- and cell-based approaches. Curr Opin Biotechnol. 2000 Feb;11(1):47-53.
3. Vicky M Avery, David Camp, et al. The Identification of Bioactive Natural Products by High Throughput Screening (HTS). Comprehensive Natural Products II. Volume 3, 2010, Pages 177-203.
4. Michael A Dabrowski 1, Kim Dekermendjian, Per-Eric Lund, Johannes J Krupp, Jon Sinclair, Olof Larsson. Ion channel screening technology. CNS Neurol Disord Drug Targets. 2008 Apr;7(2):122-8.
5. Jin-feng Yue, Guan-hua Qiao, Ni Liu, Fa-jun Nan, Zhao-bing Gao. Novel KCNQ2 channel activators discovered using fluorescence-based and automated patch-clamp-based high-throughput screening techniques. Acta Pharmacol Sin. 2016 Jan; 37(1):105-10.
6. Xin Tang, Jesse Drotar, Keji Li, Cullen D Clairmont, Anna Sophie Brumm, Austin J Sullins, Hao Wu, Xiaoxiao Shawn Liu, Jinhua Wang, Nathanael S Gray, Mriganka Sur, Rudolf Jaenisch. Pharmacological enhancement of KCC2 gene expression exerts therapeutic effects on human Rett syndrome neurons and Mecp2 mutant mice. Sci Transl Med. 2019 Jul 31;11(503):eaau0164.
7. Xiao-Tong Hu, Bing-Lin Zhu, Li-Ge Zhao, Jing-Wen Wang, Lu Liu, Yu-Jie Lai, Ling He, Xiao-Juan Deng, Guo-Jun Chen. Histone deacetylase inhibitor apicidin increases expression of the α-secretase ADAM10 through transcription factor USF1-mediated mechanisms. FASEB J. 2017 Apr;31(4):1482-1493.
8. Zhe-Rui Zhang, Hong-Qing Zhang, Xiao-Dan Li, Cheng-Lin Deng, Zhen Wang, Jia-Qi Li, Na Li. Generation and characterization of Japanese encephalitis virus expressing GFP reporter gene for high throughput drug screening. Antiviral Res. 2020 Oct;182:104884.
9. Peng Wang, Juan-Carlos Alvarez-Perez, et al. A high-throughput chemical screen reveals that harmine-mediated inhibition of DYRK1A increases human pancreatic beta cell replication. Nat Med. 2015 Apr;21(4):383-8.
10. Larisa Goričan, Boris Gole, Uroš Potočnik. Head and Neck Cancer Stem Cell-Enriched Spheroid Model for Anticancer Compound Screening. Cells. 2020 Jul 16;9(7):1707.
11. Vincent Blay, Bhairavi Tolani, Sunita P Ho, Michelle R Arkin. High-Throughput Screening: today's biochemical and cell-based approaches. Drug Discov Today. 2020 Aug 12; S1359-6446(20)30305-6.
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