研究背景

1、心力衰竭影響全球 2600 多萬人，心力衰竭的主要潛在原因是成年人心肌在受傷后無法自行修復。

2、哺乳動物的心臟在受傷后早期能夠通過心肌細胞增殖實現再生。

 

■ 重要“人物” 介紹

 

Meis1：由 Meis1 基因表達。Meis1 是 TALE 家族中一種非 Hox 同源異型盒基因。Meis1 是細胞周期阻滯的關鍵調控因子，在胚胎心肌細胞發育中起重要作用。

 

Hoxb13：同源域轉錄因子，是前列腺上皮細胞分化的關鍵調節因子，與細胞周期的調控有關。

 

Calcineurin：鈣調神經磷酸酶，細胞質中一種 Ca²⁺/CaM (鈣調蛋白) 依賴性蛋白磷酸酶。當 Calcineurin 被鈣激活時，通過其下游轉錄效應因子 NFAT (活化 T 細胞核因子) 介導肥厚反應，NFAT 直接被 Calcineurin 去磷酸化并發生核轉位。

 

圖 1. Calcineurin 在糖尿病動脈粥樣硬化和心力衰竭中的作用通路 ^[7]

早在 2013 年，Hesham A. Sadek 研究團隊在 Nature 發表的文章中，就將 Meis1 鑒定為心肌細胞增殖的關鍵轉錄調節因子，并認為它是心臟再生的潛在治療靶標。

摘要

1、Hoxb13 是再生心肌細胞中再生關鍵因子 Meis1 的輔助因子。

 

2、成年小鼠心臟 Meis1 和 Hoxb13 雙敲后促進心肌細胞有絲分裂，使肌節處于松散狀態，改善心肌梗死后左心室收縮功能。

 

3、Meis1 和 Hoxb13 協同調節心肌細胞成熟和細胞周期。

 

4、Calcineurin 使 Hoxb13 在 Serine 204 位點 (Hoxb13^S204) 處去磷酸化，促進其核轉運和細胞周期阻滯。

 

研究方法

■ 動物模型

 

條件性心肌細胞特異性 Hoxb13 基因敲除的 Hoxb13-KO 小鼠 (Myh6^cre : Hoxb13^fl/fl)；

Tamoxifen 誘導型心肌細胞特異性 Hoxb13 蛋白缺失的 Hoxb13-iKO 小鼠 (Myh6^mERcremER Hoxb13^fl/fl)；

心肌特異性 Myh6^cre : Meis1-Hoxb13 雙敲除的 DKO 小鼠；

條件性誘導 Meis1 和 Hoxb13蛋白 缺失的 DiKO 小鼠。

 

■ 主要實驗方法

 

免疫熒光染色；免疫印跡 (WB) ；免疫共沉淀 (Co-IP) ； 染色質免疫共沉淀結合下 一代測 序 (ChIP-seq) ；磁共振成像；經胸超聲心動圖檢測；TUNEL 分析。

 

實驗結果

■ Hoxb13 與 Meis1 的關聯

 

此前的研究中，Sadek 的研究團隊已經發現 Hox 蛋白家族與 Meis1 有緊密聯系。在這次的研究中，通過在心臟損傷后進行再修復的 7 天內 (P1-P7) 檢測 Hoxb13 蛋白家族的表達發現，Hoxb13 是再生后心肌細胞中與 Meis1 相互作用的轉錄因子。

 

圖 2. 再生后早期 Hoxb13 的表達與 Meis1 相關
【Postnatal day：再生后天數；
P1：Hyperplastic growth，增生性生長; 
P7：Hypertrophic growth，肥厚性生長】

■ Hoxb13 的遺傳缺失

首先，研究團隊通過 Hoxb13-KO 小鼠發現，短時間內 Hoxb13 的缺失誘導心肌細胞增殖。另外，在注射 Tamoxifen 后，成年 Hoxb13-iKO 小鼠心臟 Hoxb13 蛋白減少，心肌細胞橫截面積 (CSA) 顯著減小，單核心肌細胞的比例也顯著增加，而雙核和多核心肌細胞的比例顯著下降。兩種小鼠實驗結果表明，心肌細胞特異性 Hoxb13 缺失足以誘導成年小鼠心肌有絲分裂。

圖 3. Hoxb13 缺失誘導小鼠心肌細胞有絲分裂和左心室射血分數 (LVEF) 的下降

除此之外，成年 Hoxb13-KO 小鼠中誘導了心肌梗死 (MI)，發現 Hoxb13 的敲除可以防止 LVEF 的下降，但是左心室收縮功能并沒有改善。總的來說，Hoxb13 的缺失可預防 MI 后收縮功能的逐步惡化，但不會引起實質性功能恢復。

 

 

■ Meis1 和 Hoxb13 蛋白共同缺失

 

Meis1-Hoxb13 的缺失，即 DKO 小鼠心臟中發現了心臟再生的一些特征，如心肌細胞肌小節分解，單核心肌細胞增加。并且觀察到成年小鼠中心肌細胞的增殖也很活躍。他們再進行了進一步的研究，以評估 Meis1 和 Hoxb13 缺失對心肌肥大的影響，發現 DKO 心臟表現出運動誘發的生理性肥厚反應減弱。

 

圖 4. DKO 小鼠心臟表現出
減弱運動誘發的生理性肥大反應

 

■ DiKO 小鼠中的心臟再生

 

那么成年小鼠心臟中條件性誘導的 Meis1 和 Hoxb13 缺失是否能促進心肌細胞重新進入分裂周期呢？首先，觀察發現 DiKO 小鼠的心臟體重比變大，注射 Tamoxifen 后，心肌細胞橫截面積減少了約 30％，并且觀察心肌細胞的數量與有絲分裂發現，Meis1-Hoxb13 特異性缺失會誘導成年小鼠心室心肌細胞增殖。

 

為了檢測心肌細胞增殖水平增加是否有助于成年心臟的修復，對 DiKO 小鼠進行 MI 干預，結果表明，Meis1 和 Hoxb13 的缺失誘導心肌細胞增殖，可以改善 MI 后的左心室收縮功能。

 

圖 5. DiKO 小鼠的左心室收縮功能改善

 

另外，Meis1 和 Hoxb13 的體內靶標鑒定發現了三組不同的基因：分別是同時靶標 Meis1 和 Hoxb13 的 272 個基因，1,647 個僅靶標 Meis1 的基因和 1,326 個僅靶標 Hoxb13 的基因。通路分析證明，Meis1  和 Hoxb13 協同調節心肌細胞的分化和細胞周期。

 

■ Calcineurin 調節 Hoxb13

蛋白免疫印跡 (WB) / 免疫共沉淀 (Co-IP)  結果顯示  (蛋白提取過程中別忘了使用蛋白酶和磷酸酶抑制劑來保護它們喲，戳一戳，MCE 官網直接可申請 蛋白酶抑制劑 、 磷酸酶抑制劑  Cocktail  試用裝哦！) ，與 Meis1 和 Hoxb13 相似，P7 時鈣調神經磷酸酶的催化亞基 CnA 的蛋白水平升高，并且這三種蛋白相互作用。掃描 Calcineurin 對接基序結果表明，Calcineurin 與 Hoxb13 直接相互作用，并可能將它去磷酸化。進一步地，他們找到了作用位點 S204，Calcineurin 依賴性的 Hoxb13^S204 去磷酸化作用促進了Hoxb13 的核轉運，并促進了細胞周期的阻滯。
 

圖 6. CnA 在 P7 天的表達量升高

 

■ Calcineurin 調控心肌細胞增殖

先前有報道表明，心肌細胞中 CnA 的過度表達會導致嚴重的病理性肥大。一致的，Sadek 研究團隊也證明了強制表達激活的 Calcineurin 會導致心肌細胞增生過早轉變為心肌細胞肥大，而抑制 Calcineurin 則延長了心肌細胞的增殖期。

圖 7. CnA-Tg 心臟顯示 LVEF 明顯降低，

并伴有明顯的疤痕

【CnA-Tg：Ppp3ca (編碼 CnA) 基因持續活躍表達；Rcan1-Tg：Rcan1 (表達內源性 Calcineurin 抑制物) 基因持續活躍】

結論

研究確定了 Hoxb13 是心肌細胞分化和增殖的重要調節因子，證明了 Meis1 和 Hoxb13 協同調節心肌細胞成熟和細胞周期，并且發現了 Calcineurin 在調控中重要的作用，靶向 Calcineurin-Hoxb13 軸可能有助于治愈心臟損傷。

 

 

相關產品

Tamoxifen	口服有效的，選擇性雌激素受體 (estrogen receptor) 調節劑 (SERM)。可誘導 Hoxb13 基因缺失。
Voclosporin	鈣調神經磷酸酶 (Calcineurin; PP2B) 抑制劑。
Fenvalerate	鈣調神經磷酸酶 (Calcineurin; PP2B)  抑制劑，對 PP2B-Aα 的 IC50 為 2-4 nM。
Cyclosporin A	免疫抑制劑，能與親環素結合，抑制鈣調神經磷酸酶 (Calcineurin; PP2B) 活性的 IC50 值為 7 nM。
Tacrolimus	大環內酯類，與 FK506 結合蛋白 (FKBP) 結合形成復合物并抑制鈣調神經磷酸酶 (Calcineurin; PP2B) ，從而抑制 T 淋巴細胞信號轉導和 IL-2 轉錄。具有強免疫抑制特性。
Tacrolimus monohydrate
Omecamtiv mecarbil	心臟特異性的肌球蛋白 (cardiac myosin) 激活劑。
Mavacamten	心肌肌球蛋白的調節劑，其在牛心臟和人心臟中的 IC50 值分別為 490，711 nM。
Danicamtiv	心臟肌動蛋白 (cardiac myosin) 的選擇性變構活化劑。
Protease Inhibitor Cocktail	蛋白酶抑制劑 Cocktail 可以用于細胞或組織提取物用來增加蛋白穩定性。
Protease Inhibitor Cocktail,  mini-Tablet
Phosphatase Inhibitor  Cocktail I	磷酸酶抑制劑 Cocktail I/ II/ III 廣譜性抑制酸性磷酸酶、堿性磷酸酶和蛋白酪氨酸磷酸酶 (PTPs)，用于維持蛋白的磷酸化狀態。
Phosphatase Inhibitor  Cocktail II
Phosphatase Inhibitor  Cocktail III

縮寫：
TALE：Three amino acid loop extension
Meis1：Myeloid ecotrophic insertion site 1
NFAT：Nuclear factor of activated T cells
CSA：Cardiomyocyte cross-sectional area
MI：Myocardial infarction
LVEF：Left-ventricle ejection fraction


原文閱讀 ： Ngoc Uyen Nhi Nguyen, et al. A calcineurin-Hoxb13 axis regulates growth mode of mammalian cardiomyocytes. Nature. 2020 Jun; 582(7811): 271-276.

參考文獻 

↓ 下滑查看更多文獻 

1. Ngoc Uyen Nhi Nguyen, et al. A calcineurin-Hoxb13 axis regulates growth mode of mammalian cardiomyocytes. Nature. 2020 Jun; 582(7811): 271-276.

2. Shalini A. Muralidhar, et al. Meis1 regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest. Nature volume 497, pages249–253(2013).
3. Satwat Hashmi, et al. Molecular switch model for cardiomyocyte proliferation. Cell Regen. 2019 Jun; 8(1): 12–20.
4. Jiqiang Yao, et al. The Homeobox gene, HOXB13, Regulates a Mitotic Protein-Kinase Interaction Network in Metastatic Prostate Cancers. Sci Rep. 2019 Jul 4; 9(1): 9715.
5. Hui-Bin Liu, et al. Calcineurin and electrical remodeling in pathologic cardiac hypertrophy. Trends Cardiovasc Med. 2010 Jul; 20(5): 148-53.
6. Benjamin J Wilkins, et al. Calcium-calcineurin signaling in the regulation of cardiac hypertrophy. Biochem Biophys Res Commun. 2004 Oct 1; 322(4): 1178-91.