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通過ALPHA surefire ultra技術(shù)進(jìn)行定量的細(xì)胞水平磷酸化檢測

瀏覽次數(shù):2460 發(fā)布日期:2020-4-28  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)
小膠質(zhì)細(xì)胞是髓系細(xì)胞,在介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS) 中的炎性反應(yīng)方面起重要作用。在其他任務(wù)中,小膠質(zhì)細(xì)胞負(fù)責(zé)識別和消除外來入侵者,并修復(fù)由損傷引起的局部 CNS 組織損害。小膠質(zhì)細(xì)胞受體-接頭蛋白復(fù)合體 [稱為骨髓細(xì)胞 2 表達(dá)的觸發(fā)受體 (TREM2) 和 12 kDa DNAX 激活蛋白 (DAP12)] 的功能經(jīng)證實在 AD 和帕金森病等多種神經(jīng)退行性疾病中非常重要。TREM2 和 DAP12 之間的相互作用很可能介導(dǎo)與吞噬和碎片清除、促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生和釋放的調(diào)節(jié),以及促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞增殖和存活的轉(zhuǎn)錄變化有關(guān)的多種神經(jīng)炎性反應(yīng)。因此,TREM2/DAP12 功能變化直接影響小膠質(zhì)細(xì)胞激活的時間和程度,從而影響神經(jīng)元功能和存活。

TREM2 是一種跨膜糖蛋白,由胞外免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)部分,其中胞質(zhì)部分與 DAP12 結(jié)合,起到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。TREM2 有來自病原體的外源配體,還有暫時尚未明確的內(nèi)源配體。胞外配體結(jié)合會激活 TREM2,這反過來會激活 DAP12,從而導(dǎo)致胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)。具體而言,DAP12 包含一個基于免疫受體酪氨酸的激活基序 (ITAM),其中酪氨酸殘基在 TREM2 結(jié)合配體時會被磷酸化。然后這會募集 Syk 激酶來激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。
本文采用了 TREM2-/- 的小鼠對 TREM2 在脂質(zhì)代謝以及 TREM2 缺失引起的小膠質(zhì)細(xì)胞的膽固醇堆積的來源進(jìn)行了探討。發(fā)現(xiàn)TREM2在小膠質(zhì)細(xì)胞脂質(zhì)代謝過程中的重要作用以及myelin是膽固醇堆積的重要來源。TREM2 正常表達(dá)的動物和細(xì)胞在 TREM2 收到激活后,可以引起 DAP12 的自磷酸化,進(jìn)一步招募 SYK 蛋白并將其磷酸化,激活 SYK 信號通路,激活下游的 DAM 和脂類代謝的基因,從而將小膠紙細(xì)胞吞噬的 myelin 膽固醇正常代謝為自由化的膽固醇。本文前期的大量的細(xì)胞實驗和動物實驗都驗證了 TREM2 的功能,同時也構(gòu)建了SYK的磷酸化檢測平臺,通過 ALPHA surefire ultra 的技術(shù)對 SYK 的磷酸化水平進(jìn)行定量分析。
 
ALPHA surefire ultra技術(shù)是珀金埃爾默公司基于ALPHA平臺開發(fā)出的細(xì)胞磷酸化檢測工具。新的 AlphaLISA Surefire Ultra 采用成熟的 CaptSureTM 技術(shù)代替 Protein A,不僅實現(xiàn)了試劑盒抗體捕獲的特異性,而且具有更低的檢測背景。新的試劑盒利用 AlphaLISA 受體微珠代替 AlphaScreen 受體微珠,對血紅蛋白淬滅干擾具有更加出色的光譜特性。ALPHA 檢測本身非常簡單。
 

ALPHA surefire Ultra 平臺的特點:
  • 步驟簡單,減少時間和人工
  • 細(xì)胞樣本經(jīng)過刺激、裂解后,只需要將試劑組分加入裂解液,無需任何多余的洗滌步驟。
  • 高靈敏度及定量化檢測
  • 檢測靈敏度大于等于 Western Blot 方法;可以檢測過表達(dá)蛋白靶點及內(nèi)源水平表達(dá)的蛋白;可以使用穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系或原代細(xì)胞及干細(xì)胞進(jìn)行試驗。
  • 高Z'值和信號窗口
  • 可以獲得更高的信噪比、更低的cv以及更穩(wěn)定的assay。
  • 通量高的同時上樣量少
  • 可以兼容 96、384 或 1536 孔板的不同檢測模式,適合于微孔板樣品,樣品只需 5uL 或以下的體積。
本文中將 TREM2 和 DAP12 共同表達(dá)在 293T 細(xì)胞中共同表達(dá),以此為平臺使用不同的脂類和蛋白類物質(zhì)進(jìn)行刺激,然后檢測其 Syk 的磷酸化水平的變化。

珀金埃爾默同時提供Phospho-Syk (Tyr352)和total Syk檢測試劑盒。

同時 ALPHA 最新的技術(shù)也支持磷酸化蛋白和總蛋白同時檢測:
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Phospho-Syk (Tyr352)檢測試劑盒
total Syk檢測試劑盒

另外還有Syk的下游激活的PI3K、ERK、NFκB等信號通路,根據(jù)具體環(huán)境,這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)可差異性和協(xié)同性參與,從而影響各種小膠質(zhì)細(xì)胞功能,包括受體介導(dǎo)的吞噬、β-catenin 和 mTOR 復(fù)合體 1 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、通過 PIP 2/3 介導(dǎo)的 AKT 和 mTOR 復(fù)合體 2 激活實現(xiàn)的代謝平衡、導(dǎo)致促炎性分子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的 RAS/MEK/ERK 激活,以及導(dǎo)致肌動蛋白重構(gòu)的鈣調(diào)節(jié)。除了這些信號通路以外神經(jīng)退行性疾病也會導(dǎo)致 Tau 蛋白等的磷酸化水平發(fā)生變化。這些變化都可以通過 ALPHA surefire ultra 的平臺進(jìn)行定量檢測。

同時珀金埃爾默公司還提供高品質(zhì)的 ALPHA Assay 檢測設(shè)備:
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EnVision多標(biāo)記微孔板讀板儀
 
EnSight多標(biāo)記微孔板讀板儀
 
Victor Nivo多標(biāo)記微孔板讀板儀
 

在淀粉樣蛋白斑中,TREM2 是小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬功能的關(guān)鍵。本文還進(jìn)行了 Myelin 被小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬實驗,該實驗采用Opera Phenix HCS System和 HarmonyHCA Software 進(jìn)行自動化拍攝和定量分析。
 
產(chǎn)品名稱 圖片展示 掃描二維碼獲取詳細(xì)產(chǎn)品信息
Opera Phenix 高內(nèi)涵系統(tǒng)

 
發(fā)布者:瑞孚迪(Revvity)
聯(lián)系電話:021-60645803
E-mail:gc.marcom@revvity.com

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