一抗的選擇要點

1. 選擇單克隆還是多克隆抗體？由一種B細胞產生的單一特異性抗體叫做單克隆抗體，單克隆抗體能目標明確地與單一特異抗原決定簇結合，就像導彈精確地命中目標一樣。另一方面，即使是同一個抗原決定簇，在機體內也可以由好幾種B細胞產生抗體，形成抗體混雜物，稱為多克隆抗體。在抗原抗體反應中，一般單克隆抗體特異性強，但親和力相對小、檢測抗原靈敏度相對較低；而多克隆抗體特異性稍弱、抗體的親和力強、靈敏度高，但易出現非特異性染色（實驗時可以通過封閉等盡量避免非特異性染色）。

2. 抗體的種屬來源。一般兔來源的抗體多是多克隆；而小鼠來源的抗體多是單克隆，但也有例外。抗體的來源這點非常重要，后面檢測時帶標記的二抗必須與一抗來源相匹配。

3. 實驗目的是檢測什么種屬的抗原，即Species Reactivity。這一點很重要，一般說明書上都有注明，如小鼠Mouse、大鼠Rat、人Human等等，選購時盡量選擇說明書上已經標注反應性的抗體。

4. 能否做免疫組化？一般一抗說明書都會注明是否能做WB、IHC、ICC、IF等，建議最好選擇注明的抗體，因為一般都是經過實驗驗證的。

5. 檢測標本類型。用戶是檢測石蠟切片還是冰凍切片，一般能做石蠟切片的抗體，都可以用來檢測冰凍切片；但能做冰凍切片的抗體，不一定能檢測石蠟切片中的抗原。

6. 價格與質量。進口抗體時間長，且價格高，很多都是國內廠家OEM的，科研型的抗體屬于濃縮型抗體，需要多摸索幾次實驗條件，建立合適的實驗條件后再進行大批量的實驗，并且實驗操作者的熟練程度、對實驗的把控等對實驗結果影響也很大，實驗細節一定要把控好。另外，抗體切記避免反復凍融。 

二抗的選擇

1. 種屬來源。主要根據一抗種屬來源來決定購買二抗來源，如一抗是小鼠來源，那二抗就買抗小鼠的即可（二抗來源goat or Rabbit均可）；如一抗是兔來源，那二抗就買抗兔的即可。

2. 標記物的選擇。常見的標記物有HRP、Biotin、熒光素等。免疫組化現階段多用二步法，二步法使用的二抗通常是帶多聚HRP標記的，普通的HRP標記應用到免疫組化效果會比較差；前幾年應用比較多的三步法，二抗上帶Biotin標記，然后加入HRP標記的鏈霉素進一步反應。而免疫熒光染色就需要購買熒光素標記的二抗，如羅丹明、FITC、Cy3等常用熒光素。如何選擇二抗主要看實驗應用是免疫組化還是免疫熒光。

3. 選擇IgM還是IgG。二抗需與一抗的類別或亞型相匹配，這通常是針對單克隆抗體而言。多克隆抗體主要是IgG類免疫球蛋白，因此相應的二抗就是抗IgG抗體

    單克隆抗體的類別及亞型通常會在產品列表中列出，如果你的一抗是小鼠IgM，那么相應的二抗就應當是抗小鼠IgM，或是抗小鼠IgG抗體。如果單克隆一抗是小鼠IgG的某一亞型（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么幾乎所有的抗小鼠IgG都可以與之結合，或者你也可以選擇專門針對這一亞型的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠IgG1，那么你可以選擇抗IgG1的二抗，此種抗體在雙標記實驗中尤其適合。如果你不知道一抗是哪一類別或亞型，那么抗小鼠IgG是一個不錯的選擇，因為此種抗體可以識別大多數類型的IgG免疫球蛋白。

     流式細胞實驗過程中，熒光抗體對單細胞懸液的標記效果直接影響實驗的數據質量。因此選購流式抗體時需要綜合考慮各種影響抗體品質及檢測效果的因素，例如抗體的特異性、熒光素信號的強弱、熒光素標記的方式、同型對照等等。

如何選擇合適的流式抗體？

1.     流式抗體本身也是抗體，所以選擇流式抗體首先要滿足抗體選擇最基本的條件：目標蛋白識別特異性、反應種屬以及應用實驗；
2.     流式抗體熒光標記的方式包括直接標記和間接標記兩種。在流式實驗過程中，遵循盡量減少實驗工序和過程以保證實驗的真實性和準確性，因此在條件允許的范圍內，建議盡量用直接標記的抗體進行實驗；
3.     流式抗體熒光標記的選擇：不同熒光標記在不同的儀器上強度不同，以FACS Calibur儀器為例：PE ＞APC ＞PE-Cy5 ＞PerCP＞FITC ＞PerCP-Cy5.5，通常來說，PE最強，適用于弱表達抗原；FITC強度較弱，適用于強表達抗原并且使用范圍比較廣泛。如果實驗中檢測單一指標，用戶可根據檢測的目標蛋白表達豐度進行選擇同時可兼顧標記抗體的價格等綜合因素；如果同時檢測多個指標，用戶先需要確認流式細胞儀能檢測多少個通道-------流式抗體每個通道只能選擇1種熒光素，各個通道之間的熒光素可以隨意搭配，比如實驗者同時檢測三個指標，可以在下圖中綠色、黃色和紅色三個通道中各選一個適當的熒光素標記，例如FITC、PE和PE-Cy5。切忌所有指標選擇同一個通道的熒光標記，以防止熒光的重疊和相互干擾，影響最后的實驗結果。因此，流式細胞儀的通道越多，同一份樣本可同時做的表面/胞內標志就越多。常用的熒光標記包括FITC, PE, PE-Cy5, PE-Cy5.5, APC等。

同型對照的選擇

    流式細胞實驗和其他抗體相關實驗有點不同的就是需要選擇同型對照。同型對照是用于消除由于抗體非特異性結合到細胞表面而產生的背景染色，相當于實驗的陰性對照。同型對照選擇與標記抗體同種屬來源、同亞型、同熒光標記的抗體。例如抗人的CD3的PE標記的抗體，如果抗體來源于小鼠、亞型為IgG2a的話，就必須選擇PE標記的小鼠的IgG2a作為同型對照。

流式抗體使用注意事項

1. 建議實驗細胞的數量和抗體的比例要適當。細胞過量或抗體過量都可能影響到實驗結果，因此建議實驗前先優化一下試驗條件。注：不同的流式技術對抗體的需求量有較大差異，例如傳統流式細胞術 （采用鞘液流系統）需要1×106個細胞為起始上樣量，抗體用量為10 μL，而微流式細胞術則只需5×105個細胞，抗體用量相應的可減少到5 μL。
2. 帶熒光素標記的流式抗體應該4℃避光保存，不要冷凍。

相關參考

    流式細胞術（Flow Cytometry，FCM）：是一種對液流中排成單列的細胞或其它生物微粒（如微球、細菌、小型模式生物等）逐個進行快速定量分析和分選的技術。流式細胞術產生于上世紀六七十年代，具有速度快、精度高、準確性好等優點，是非常先進的細胞定量分析技術。該技術被廣泛的應用于細胞生物學、免疫學、血液學、腫瘤學、藥理學、遺傳學及臨床檢驗等多個領域，如細胞周期、細胞凋亡、細胞活力的檢測、淋巴細胞亞群與疾病的關系研究、器官移植后的免疫學監測、腫瘤的特異性指標的檢測、藥物作用機制研究、篩選新藥等等。