穩轉株即穩定表達細胞株，指的是基于某一細胞系構建的持續過表達或干擾某特定基因的細胞系。慢病毒感染-藥物篩選法是目前廣泛應用的穩轉株構建方法，具有高效整合、目標細胞廣泛等特點。

 

一．準備及預實驗

• 確定細胞系相關信息，需包括如下內容

目標細胞系培養條件

目標細胞增殖速度

支原體污染情況

注：為避免慢病毒感染后細胞死亡，務必保證細胞無支原體污染！ 

• 預實驗確定MOI值

• 查閱文獻確定慢病毒在目標細胞系中的MOI；
• 參考查閱得到的數據，設計梯度實驗，摸索最適MOI。

• 預實驗確定篩選藥物用量：

• 查閱Puromycin/Blastincidin等在目標細胞系中穩轉株篩選的致死用量信息；
• 參考查閱得到的數據，確定3個藥物濃度梯度（如沒有相關信息，則需將藥物濃度梯度范圍增大，數量增多至6個）；
• Day0將細胞鋪于6孔板中，使Day1細胞融合度約90%；
• Day1按（2）中設置的藥物梯度，加入藥物；
• Day4換液，并重新加入藥物； 
• Day7觀察，找到致死率100%的孔，該孔使用的藥物濃度，即為藥物篩選濃度。

附1：經驗篩選藥物用量

 

二．穩轉株篩選及構建

注：以下實驗參數，按1株穩轉株為例描述，實驗需考慮有無對照穩轉株！

• 細胞鋪板：

將細胞接種于6孔板中（4個孔），使次日細胞融合度約70%

• 病毒感染：

根據預實驗確定的MOI值，計算慢病毒體積，添加慢病毒（每孔添加ADV-HR 2μL）；

• 換液：

慢病毒感染次日，將細胞進行換液處理；

• 觀察感染效率：

感染后72小時，觀察感染效率，效率最低不應低于40%。

• 篩選：

• 多克隆穩轉株：從感染72小時后開始于6孔板中加篩選藥物，每隔2天，重新換液加入藥物。藥物篩選需至少持續14天，直至顯微鏡下觀察熒光細胞比例為100%。

注：第一次加入藥物時在上午進行，4-6小時后觀察細胞狀態，如細胞死亡過多，需更換新鮮不含藥物的培養基。

附2：多克隆穩轉株

 

多克隆穩轉株的熒光通常強弱夾雜。

• 單克隆穩轉株：建立在獲得多克隆穩轉株基礎上

• 有限稀釋法：

 

 

• 取24個1.5毫升EP管，每管中加入800微升完全培養基；
• 用胰酶將多克隆穩轉株消化（90%融合度，10毫升培養基終止消化），取80微升至第一個EP管中，混合均勻

注：應使用1000微升槍尖，混合時不要過度吸打，以免破壞細胞。

• 從第一個EP管中取80微升至第二個EP管中，混合均勻，以此類推。
• 將EP管中的細胞懸液，以每孔100微升，接種于96孔板中；
• 過夜培養后，觀察第12-24列，尋找只含有1個細胞的孔，并做好標記；
• 培養3-4周，待標記孔中細胞擴增后，消化傳代擴增，即為單克隆穩轉株細胞。

注：培養的第一周不要換液，接下來每3-4天換液。

• 平板挑取法

 

• 計數100個多克隆穩轉株細胞，接種于一個10cm培養盤中；

注：盡量吹打均勻，防止細胞聚團。

• 過夜培養后，觀察并尋找單個細胞的位置，并在盤底做標記；
• 培養培養2周；

注：培養的第一周不要換液，接下來每3-4天換液。

• 待標記處的細胞擴增為肉眼可見的白點，在移液器尖端吸取一點胰酶，緩慢滴至細胞處，待細胞消化后，迅速吹打，將消化下的細胞轉移至96孔板中，傳代擴增，即為單克隆穩轉株細胞。約需2-3周的時間。

注：每盤選取20個為宜，在消化時，需按照先消化邊緣的，再消化中心的原則，防止克隆之間的相互污染。培養的第一周不要換液，接下來每3-4天換液。

附3：單克隆穩轉株

 

單克隆穩轉株的熒光強度基本一致。

 

三、穩轉株構建中的常見問題

1.支原體污染問題

由于輕度的支原體污染并不影響細胞的生長和增殖，故被許多實驗室所忽略。但支原體易在病毒感染細胞后爆發，出現大量細胞碎片，甚至導致細胞死亡，導致穩轉株篩選的失敗。我們建議在穩轉株構建之初，務必排除細胞及培養環境中的支原體污染。

2. 其他問題

除支原體污染之外，還有以下問題會經常出現于穩轉株構建中。