四川大學(xué)華西醫(yī)院周圣濤教授擅長腫瘤、子宮肌瘤以及子宮內(nèi)膜異位等良惡性婦科疾病的診斷和治療。近期，該課題組應(yīng)用美國Arraystar LncRNA芯片分析了趨化因子CXCL14介導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞中長鏈非編碼RNAs（lncRNAs）的表達(dá)情況，篩選到大量異常表達(dá)的lncRNAs，并且對其中的LINC00092的機(jī)制進(jìn)行了深入研究。該研究成果于2017年發(fā)表在國際著名學(xué)術(shù)期刊Cancer Research（IF=8.556）上。（芯片實(shí)驗(yàn)由康成生物提供技術(shù)服務(wù)）

研究背景
    卵巢癌是婦科疾病中比較常見的惡性腫瘤，據(jù)報(bào)道年發(fā)病率在0.03-0.12‰。因?yàn)樵摷膊≡谠缙谌狈μ禺愋园Y狀，大多數(shù)患者被診斷時(shí)已經(jīng)處于腫瘤晚期。作者前期研究表明卵巢癌相關(guān)的成纖維細(xì)胞（CAFs）可以促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展，并且CAFs中趨化因子CXCL14的表達(dá)量相對于正常卵巢成纖維細(xì)胞（NAFs）明顯升高。接著，作者做了一系列的實(shí)驗(yàn)證明CAFs是通過CXCL14來促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展的。但是，CXCL14促進(jìn)卵巢癌發(fā)生的作用機(jī)制仍是未知。
    研究表明lncRNAs在卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，但是沒有直接證據(jù)表明CAFs促進(jìn)卵巢癌發(fā)生的過程中l(wèi)ncRNA是否發(fā)揮功能。因此，作者對于CAFs分泌的CXCL14是否是通過誘導(dǎo)下游lncRNA表達(dá)水平的改變來促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生進(jìn)行了探究。

研究思路
    為了探究CXCL14異常表達(dá)促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生中l(wèi)ncRNAs的表達(dá)水平是否發(fā)生變化，作者構(gòu)建了CXCL14突變的細(xì)胞模型，并且借助美國Arraystar Human lncRNA array檢測了CXCL14突變株和野生型細(xì)胞中l(wèi)ncRNAs的表達(dá)情況。根據(jù)芯片結(jié)果，作者選取了上調(diào)最顯著的5個(gè)lncRNA分子（RP11-119F7.5, ZEB1-AS1, XLOC_000493, RP11-12L2.4, and LINC00092）進(jìn)行功能驗(yàn)證（Loss of Function），發(fā)現(xiàn)只有LINC00092的表達(dá)水平發(fā)生變化會(huì)影響卵巢癌細(xì)胞的遷移能力。因此，作者就將LINC00092作為CXCL14調(diào)控癌細(xì)胞發(fā)生和發(fā)展的下游靶基因做了進(jìn)一步探究。
接著，作者又設(shè)計(jì)了針對LINC00092的siRNA來驗(yàn)證該分子在卵巢癌代謝中的功能。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LINC00092表達(dá)水平的降低會(huì)顯著抑制癌細(xì)胞的侵襲能力，增加細(xì)胞凋亡。同時(shí)，作者還發(fā)現(xiàn)過表達(dá)LINC00092可以回補(bǔ)沉默CXCL14所導(dǎo)致的生物學(xué)功能。
    糖酵解過程在腫瘤發(fā)生和癌癥發(fā)展中起到重要的作用，并且已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道lncRNA可以通過多種機(jī)制來調(diào)控糖酵解，因此作者探究LINC00092是否也是通過調(diào)控糖酵解過程來促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲除LINC00092會(huì)使得癌細(xì)胞內(nèi)很多代謝產(chǎn)物的含量明顯降低，尤其是乳酸的含量變化最為明顯。上述實(shí)驗(yàn)表明LINC00092可以改變卵巢癌細(xì)胞代謝過程中的糖酵解水平。然后，作者開始研究LINC00092在改變糖酵解過程中是如何發(fā)揮功能的。借助RT-PCR和RNA pull down實(shí)驗(yàn)，作者找到了LINC00092的靶基因果糖-2,6-二磷酸酶2（PFKFB2），并且進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)LINC00092和PFKFB2的表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.52）。上述一系列實(shí)驗(yàn)也表明了LINC00092是通過結(jié)合PFKFB2來調(diào)控卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展的。
    另外，作者驗(yàn)證了PFKFB2在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的功能，發(fā)現(xiàn)敲低PFKFB2顯著降低癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，增加凋亡；同時(shí)，過表達(dá)PFKFB2可以回補(bǔ)由沉默LINC00092所導(dǎo)致的生物學(xué)功能。最后，作者證明CXCL14、LINC00092和PFKFB2在卵巢癌的代謝過程中是必不可少的三個(gè)分子。

技術(shù)路線

結(jié)果展示

圖一 芯片及qPCR驗(yàn)證結(jié)果和KM曲線
左圖：芯片篩選結(jié)果；中圖：RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果；右圖：KM曲線

圖二 LINC00092的功能驗(yàn)證（LOF）
左圖：細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)；右圖：細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

圖三 機(jī)制探究
左圖：糖酵解過程關(guān)鍵酶的qPCR驗(yàn)證結(jié)果；右圖：WB結(jié)果

研究意義
    本研究借助美國Arraystar Human LncRNA array在卵巢癌中篩選到大量異常表達(dá)的lncRNA，通過一系列的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和臨床分析發(fā)現(xiàn)LINC00092與卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展具有緊密的聯(lián)系。接著，作者對于LINC00092是如何調(diào)控卵巢癌的發(fā)生發(fā)展做了進(jìn)一步探究。總之，本研究的芯片數(shù)據(jù)對卵巢癌的診斷和治療，以及探究非編碼RNA的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

作者介紹
    周圣濤教授，臨床醫(yī)學(xué)博士，四川大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科副主任，美國生化與分子生物學(xué)協(xié)會(huì)會(huì)員，美國腫瘤研究協(xié)會(huì)會(huì)員。周教授長期從事臨床、教學(xué)和科研工作，擅長婦產(chǎn)科常見良惡性疾病診斷和治療。近年來在Cancer Res、Cancer lett和Oncotarget等期刊發(fā)表多篇SCI論文，并主持國家自然科學(xué)基金和四川省科技廳項(xiàng)目各一項(xiàng)。

原文出處
Long non-coding RNA LINC00092 acts in cancer-associated fibroblasts to drive glycolysis and progression of ovarian cancer. Cancer Research. 2017.