【蛋白研究系列專題】-4丨定量蛋白質組學方法，您值得擁有

1 背景和意義

  從生命活動的直接執行者——蛋白質的角度研究生命現象和規律（特別是疾病防治和病理研究）已成為研究生命科學的主要手段。而這些研究往往離不開對細胞、組織或器官中含有蛋白質種類和表達量的研究。對處不同時期、不同條件下蛋白質表達水平變化的研究，識別功能模塊和路徑，監控疾病的生物標志物，這些研究都需要對蛋白質進行鑒定和定量。生物質譜技術的出現和不斷成熟為蛋白質差異表達分析提供了更可靠、動態范圍更廣的研究手段。基于質譜技術，科學家們不斷開發出新的定量蛋白質組學方法，來了解細胞、組織或生物體的整體蛋白質動力學。

2 方法學介紹

  目前較主流的定量蛋白質組學方法有5種，分別是Label-free、iTRAQ、SILAC、MRM(MRMHR)、和SWATH。簡述如下：

2.1  Label-free

  Label-free定量，即非標記的定量蛋白質組學，不需要對比較樣本做特定標記處理，只需要比較特定肽段/蛋白在不同樣品間的色譜質譜響應信號便可得到樣品間蛋白表達量的變化，通常用于分析大規模蛋白鑒定和定量時所產生的質譜數據。

  Label-free操作簡單，可以做任意樣本的總蛋白質差異定量，但對實驗操作的穩定性、重復性要求較高，準確性也較標記定量差。因此，Label-free技術適合于大樣本量的定量比較，以及對無法用標記定量實現的實驗設計。

2.2  iTRAQ

  iTRAQ定量是目前定量蛋白質組學應用最廣泛的技術， 該技術的核心原理是多肽標記和定量，將多肽的含量轉化為114、115、116和117同位素的含量(或113、114、115、116、117、118、119和121的8標記)，從而簡化了定量的復雜性，最終通過多肽定量值回歸到蛋白的定量值，從而最終測定出不同樣本之間蛋白質的差異。

  iTRAQ定量不依賴樣本，可檢測出較低豐度蛋白，胞漿蛋白、膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白等，且定量準確，可同時對8個樣本進行分析，并可同時得出鑒定和定量的結果，特別適用于采用多種處理方式或來自多個處理時間的樣本的差異蛋白分析。金開瑞質譜平臺應用iTRAQ定量技術，可鑒定多達6000種蛋白（以人HepG2為例），重復樣品間的蛋白表達量相關性可達到0.95以上。

2.3  SILAC

  SILAC定量的基本原理是分別用天然同位素(輕型)或穩定同位素(中性或重型)標記的必需氨基酸取代細胞培養基中相應氨基酸，細胞經5-6個倍增周期后，穩定同位素標記的氨基酸完全摻入到細胞新合成的蛋白質中替代了原有氨基酸。不同標記細胞的裂解蛋白按細胞數或蛋白量等比例混合，經分離、純化后進行質譜鑒定，根據一級質譜圖中兩個同位素型肽段的面積比較進行相對定量，屬于體內代謝標記法。

  SILAC屬于體內標記技術，更接近樣品真實狀態，標記效率高達100%，且標記效果穩定，不僅適合于進行全細胞蛋白分析，還適合于膜蛋白的鑒定和定量，每個樣本只需要幾十微克的蛋白量。SILAC定量適用于活體培養細胞的分析，對多個樣品或同一樣品不同條件下全細胞蛋白或亞細胞蛋白進行差異比較。

2.4  MRM和MRMHR

  MRM是一種基于已知信息或假定信息設定質譜檢測規則，對符合規則的離子進行信號記錄，去除大量不符合規則離子信號的干擾，從而得到質譜信息的一種數據獲取方式，屬于目標蛋白質組。其關鍵在于首先要能夠檢測到具有特異性的母離子，然后只將選定的特異性母離子進行碰撞誘導，最后去除其他子離子的干擾，只對選定的特異子離子進行質譜信號的采集。金開瑞依據前人的工作在AB SCIEX的5600-plus 儀器上開發出了MRMHR技術，因為MRMHR采納了高精度的數據，因此選擇Transition更加可信，定量更加準確。

  MRMHR技術通過兩級離子選擇，排除大量干擾離子，使質譜的化學背景降低，目標檢測物的信噪比顯著提高，從而實現檢測的高靈敏度，并具有重現性好、準確度高等特點，特別適合于已知蛋白質序列的蛋白質表達量差異驗證，可以檢測較低豐度的蛋白，但一次MRM實驗只能檢測到20個左右的目標蛋白。

2.5  SWATH

  SWATH是瑞士蘇黎世聯邦理工學院的Ruedi Aebersold 博士及其團隊與AB-SCIEX于2012年聯合推出的一項全新的質譜采集模式技術，是 MS/MSALL技術的一種擴展。與傳統的shot-gun技術相比，SWATH采集模式能夠將掃描區間內所有的肽段母離子經過超高速掃描并進行二級碎裂，從而獲得完整的肽段信息，是一種真正全景式的、高通量的質譜技術。金開瑞現有的Triple-TOF 5600-plus質譜系統，使SWATH定量具有較高的準確度和動態范圍，可檢測到蛋白質的豐度差異極大，跨越4個數量級。

  應用SWATH采集模式，一次實驗即可獲得完整的定量與定性結果，無需進行方法優化。它可以采集樣品中所有化合物的信息，可以對所有化合物進行追溯、查詢和分析。定量方法采用高分辨模式，可以消除干擾，提高選擇性，且定量能力可與三重四級桿質譜相媲美，靈敏度和動態范圍與SRM分析水平相當。針對亞細胞結構、細菌、真菌、細胞分泌物等樣本，SWATH定量的效果非常好。

3 結語

  蛋白質組學是對一個細胞或組織所表達的蛋白質進行的系統分析，分析技術包括分離蛋白質和肽的分離科學、識別和定量分析物的分析科學和數據管理和分析的生物信息學，質譜是其關鍵性分析工具。該技術現在已經被作為普遍的發現工具來動態檢測一個細胞或組織對外來或內部干擾反應，即定量蛋白質組學。針對不同的樣本，不同的實驗分析目的，可選擇不同的定量分析技術。