1材料和方法

1.1 實驗動物

雌性Wistar大鼠86只（由中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院動物實驗室提供，合格證號：SCXK京2009-0004），在SPF級環(huán)境下飼養(yǎng)，合籠并陰道涂片確認孕0天，于孕10天維甲酸口服給藥制備胚胎脊柱裂模型[2]。

1.2 材料和設備

維甲酸；顯微鑷子、顯微剪刀、顯微針持、6-0顯微縫合線；顯微注射針[1]；手術顯微鏡；手術加熱墊；

1.3 手術方法

1.3.1 顯微外科及胎仔外科

孕16天、17天、18天孕鼠，10%水合氯醛按0.32ml/100g體重腹腔麻醉后，仰臥位固定于手術加熱墊上（預設38℃），肛門直腸內測溫。調整手術顯微鏡，座椅。常規(guī)腹部消毒，腹部正中開腹，暴露雙側子宮角，術野外圍鋪溫鹽水紗布。將一側子宮角輕輕拉出放置在紗布上，清點胚胎數量，確認胚胎頭尾位置，調整胚胎子宮部位至手術顯微鏡視野內。

鏡下確認胚胎脊柱裂部位，在對應子宮壁部位做一預置縫線荷包，逐層剪開子宮壁長約2mm，暴露羊膜，輕輕推壓子宮壁，調整脊柱裂位置至清晰暴露于鏡下術野，此時手術顯微鏡放大倍數為20倍，可以清晰見到胚胎的脊髓，滴加37℃預熱溫生理鹽水保溫保濕（圖1）。

1.3.2 顯微注射技術

本實驗中作者使用獨立吹吸顯微注射法進行操作，暴露羊膜后，抽吸約2ul轉染綠色熒光蛋白基因的骨髓間充質干細胞，將顯微注射針移至鏡下術野，迅速刺入羊膜后，輕劃羊膜，使羊水外流，對準脊髓進針約2mm深。針頭保持2s，緩慢后退針頭并吹出干細胞，干細胞完全注入后，針頭保持在組織內不動，保持注射針內壓力，停止2s，減少因組織壓力導致移植的干細胞外溢，之后迅速退出針頭，顯微注射完畢（圖2）。

輕拉預先縫合在子宮壁的荷包縫線，打結縫合，檢查子宮壁修復情況，必要時可以加針縫合加固(圖3）。將子宮輕輕推回腹腔，并輕輕擠壓腹壁，使其歸位避免腸梗阻。其它胚胎相間隔做同樣操作。                

圖1 預置縫線荷包

                       Fig.1 Preset Suture Pouch                

圖2 干細胞顯微注射

                      Fig.2 Stem Cell Microinjection               

圖3預置荷包打結

Fig.3 Preset pouch knot  

2結果

孕20天胚胎切片熒光顯微鏡下觀察脊髓內可見間充質干細胞呈現綠色熒光成活胚胎數195例，干細胞成活率98.5%，（圖4，圖5為圖4局部放大圖），證明干細胞移植成活，成功。

   圖4 脊髓內間充質干細胞（→） ×100 

          Fig.4  MSCs in Spinal ×100