銳賽小課堂0625-107
一、實(shí)驗(yàn)流程
制備慢病毒表達(dá)質(zhì)粒及其輔助載體，四個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6h更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48和72h后，分別收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，病毒上清液通過超離心濃縮病毒。

二、實(shí)驗(yàn)材料
慢病毒載體包裝系統(tǒng)為四質(zhì)粒系統(tǒng)， 組成為Gag/pol、vsvg、rev及pLenti-X-EGFP表達(dá)載體。Polo3000轉(zhuǎn)染試劑等。

三、包裝細(xì)胞293T 細(xì)胞的培養(yǎng)
（一） 293T 細(xì)胞的凍存
隨著傳代的次數(shù)增加，293T 細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)生長狀態(tài)下降、突變等。為了防止此類現(xiàn)象的出現(xiàn)，我們需要在開始就對細(xì)胞進(jìn)行大量凍存，以保證實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和持續(xù)性。在細(xì)胞對數(shù)生長期進(jìn)行凍存，增加細(xì)胞復(fù)蘇成活率。
1、去掉上清液，加入PBS 洗去殘留的培養(yǎng)基；
2、加入0.05%的胰酶，消化半1min 后，鏡下觀察細(xì)胞變圓，細(xì)胞間間隙加大時(shí)，去除胰酶，加入新鮮培養(yǎng)基吹打混勻，移入離心管中。
3、細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞全部晃下，加入 2mL 37 ℃ 預(yù)熱的 10％DMEM，用 10mL 移液管進(jìn)行吹打，較大力吹打 6-8 次即可，不留死角，之后，將所有細(xì)胞吸出，置于15mL 離心管中，取 50ul 混勻后的細(xì)胞于 1.5mL eppendorf 管中，加 入 450ul 10％ DMEM，即為10 倍稀釋，混勻，取 10ul 細(xì)胞于計(jì)數(shù)板 中計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)板上共 4 大格，每大格 16 小格。計(jì)數(shù)時(shí)，4 大格均計(jì) 數(shù)，總數(shù)除以 4（得每大格細(xì)胞數(shù)），再乘以 10（10 倍稀釋），即 為實(shí)際 n 萬/mL 細(xì)胞濃度。
4、細(xì)胞離心，1000rpm，5min。去掉上清。
5、根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果加入細(xì)胞凍存液（70%完全培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO）,重懸細(xì)胞，密度為4 x 106 個(gè)/ml。
6、分裝進(jìn)細(xì)胞凍存管，放入凍存盒中，放入-80℃超低溫冰箱。
7、第二天將細(xì)胞放于液氮罐中長久保存。
（二）293T 細(xì)胞的傳代
當(dāng)細(xì)胞生長到匯合率達(dá)到 80%~90%時(shí)需要對細(xì)胞進(jìn)行傳代操作，以擴(kuò)大細(xì)胞數(shù)量，維持細(xì)胞良好的生長狀態(tài)。
1、消化細(xì)胞，方法同細(xì)胞凍存。
2、細(xì)胞離心結(jié)束后，加入完全培養(yǎng)基重懸。
3、根據(jù)具體情況，將細(xì)胞分到10cm 培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿補(bǔ)足到10ml 培養(yǎng)基。

4、將培養(yǎng)皿平穩(wěn)放回37℃、5%CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
（三）293T 細(xì)胞的復(fù)蘇
當(dāng)細(xì)胞傳代次數(shù)過多，細(xì)胞狀態(tài)變差時(shí)，或者細(xì)胞出現(xiàn)污染事故時(shí)，需要丟棄并對最初凍存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇。
1、設(shè)置溫度為37℃的水浴。
2、查看細(xì)胞庫記錄，根據(jù)記錄從液氮罐中取出凍存的細(xì)胞（需戴上棉手套，防止被凍傷），迅速丟入水浴鍋中并快速晃動(dòng)，盡量在1min 內(nèi)使細(xì)胞溶液完全溶解。
3、將細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移到5ml 離心管中，并在其中加上1ml 新鮮的完全培養(yǎng)基，混勻后離心，1000rpm，5min。
4、去掉上清，加入2ml 新鮮的完全培養(yǎng)基，混勻沉淀后，轉(zhuǎn)入6cm 培養(yǎng)皿。
5、將培養(yǎng)皿平穩(wěn)放入37℃、5%CO2 和95%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
6、第二天觀察細(xì)胞存活率。給細(xì)胞換培養(yǎng)基。以后每天觀察細(xì)胞生長情況。

四、慢病毒包裝和濃縮
（一）293T 細(xì)胞培養(yǎng)
將細(xì)胞調(diào)整合適狀態(tài)，在70%密度左右進(jìn)行質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞培養(yǎng)液換成無抗生素培養(yǎng)基。

（二）轉(zhuǎn)染
將轉(zhuǎn)染試劑Polo3000與基本培養(yǎng)基混合（用量請參考Polo3000試劑說明書），質(zhì)粒DNA與基本培養(yǎng)基混合，室溫孵育5min后將兩者混合，放入37度培養(yǎng)箱孵育15min。再將混合液加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，混勻，細(xì)胞放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后6h 換新鮮培液。
（四）病毒收集
轉(zhuǎn)染后48 和72h 分別兩次收集病毒上清)，收集后以0.45 μm 濾器過濾,于4℃，72000g/min 離心120 分鐘；
（五）病毒重懸和保存
1ml PBS 重懸病毒沉淀，一周內(nèi)使用則置于4 度冰箱保存，如需長時(shí)間存放需置于-80 度保存。
五、感染目的細(xì)胞
不同細(xì)胞的MOI 不同，在病毒感染目的細(xì)胞前，需要做預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定細(xì)胞最佳MOI以及是否需要加入輔助增強(qiáng)劑Polybrene。
（一）細(xì)胞準(zhǔn)備
將狀態(tài)良好的目的細(xì)胞接種到24 孔板，使細(xì)胞濃度為2×105/ml細(xì)胞，接種細(xì)胞數(shù)量因細(xì)胞的生長速度而略有不同，一般是保證第二天進(jìn)行病毒感染的時(shí)候細(xì)胞匯合率在50%左右。
（二）感染
一組添加polybrene， 另一組不加。MOI=10～50 內(nèi)，每個(gè)MOI 值加2個(gè)孔，加入感染增強(qiáng)劑polybrene的一組使polybrene 最終濃度為8ug/ml, 24 小時(shí)后換液。（具體加入的病毒數(shù)可參考附表）
（三）48 小時(shí)后觀察熒光表達(dá)情況,確定細(xì)胞的MOI 值及是否需要加入Polybrene。