高靈敏度量子點與單域抗體偶聯產物檢測肺癌和乳腺癌腫瘤生物標志物HER2的研究

瀏覽次數：2891　發布日期：2015-4-13　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

文獻概述：

癌癥即惡性腫瘤，被認為是不治之癥，但如果能將癌癥或惡性腫瘤在發病早期診斷出來，就可以爭取時間，及早治療，從而大大提高癌癥患者的存活率。雖然免疫組織化學等方法已經廣泛應用于癌癥生物標志物的檢測中，但該方法干擾因素多，敏感性較低，癌癥階段判斷性不強等缺點，極易導致誤診。隨著納米生物技術的飛速發展，新型半導體納米晶體量子點逐步應用到生物醫學領域，該技術與腫瘤生物標志物的結合，將對癌癥的發病機理研究、早期診斷、靶向治療以及預后復發檢測產生積極影響。

本文介紹了一種基于量子點與抗人表皮生長因子受體2(HER2)的單域抗體（sdAbs）偶聯生成超小發光納米探針的方法，并將其成功應用于檢測肺癌和乳腺癌腫瘤細胞。研究人員首先模擬了體外腫瘤細胞生長的微環境，利用微環境培育不同的肺癌和乳腺癌細胞系，運用Western Blot以及ELISA實驗獲得不同HER2表達水平的肺癌和乳腺癌細胞系。接著采用基因工程抗體的方法制備HER2單域抗體（見圖1）：將生物標志物HER2免疫羊駝，取羊駝血清中的淋巴細胞獲取RNA，構建噬菌體抗體庫，通過ELISA篩選獲得活性高的抗HER2的單域抗體，最后通過測序獲得單域抗體可變區的序列。通過延伸PCR，構建含有his-tag和cys的單域抗體（圖2），通過原核表達獲得工程化的sdAbs-SH。然后通過4-(N-馬來酰亞胺甲基)環己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽（sulfo-SMCC）或N-(p-馬來酰亞胺基苯基)異氰酸酯（PMPI）兩種方式將sdAbs-SH與修飾氨基或羧基的量子點偶聯（圖3）。最后，用sdAbs-QDs偶聯物檢測微環境中培育的不同HER2表達水平的肺癌和乳腺癌細胞，通過激光共聚焦顯微鏡觀察肺癌和乳腺癌的染色情況，并應用流式細胞儀進行檢測分析（圖5）。文章證實與傳統的有機染料Alexa Fluor 488、568相比，在不同HER2表達水平的肺癌和乳腺癌細胞檢測中，sdAbs-QDs偶聯物的染色效果具有明顯的優越性。

研究者利用sdAbs-QDs偶聯物能夠檢測到癌癥細胞低水平表達的HER2，這種檢測方法兼具量子點優良熒光特性和超小單域抗體極強的穿透性，從而大大提高了檢測的靈敏度。該項技術將極大的推動QDs作為標記探針在癌癥研究和診斷方面的應用。該文發表于ACS NANO雜志上。

圖1：單域抗體制備過程圖

（1）用感興趣的抗原免疫羊駝。
（2）利用密度梯度離心法從血液回收外周血單核細胞。
（3）通過RT–PCR方法從總RNA反轉錄cDNA中擴增編碼單域抗體的基因，并克隆到噬菌粒載體。
（4）將外源基因庫sdAbs插入到外殼蛋白P3基因中，從而在輔助噬菌體的表面進行展示。
（5）sdAb噬菌體展示庫用免疫抗原進行吸附，沖洗掉未結合的噬菌體，將結合的噬菌體洗脫進行富集；
（6）單克隆篩選鑒定；
（7）陽性噬菌體sdAbs感染非抑制型大腸埃希菌進行可溶性分泌表達，純化，最后進行SDS–PAGE分析。