1、制備PBMC，并調整細胞濃度至107/ml。

2、在每個流式上樣管中加入100 µl準備好的細胞懸液，細胞數約為1x106個。

3、按照細胞表面抗原染色方法標記CD4和CD25。根據說明書和抗體管上的標識確定抗體用量（一般來說是20ul，可能隨批次有差異）。按個人要求設置空白管、對照管、補償管和樣本管。4 ℃孵育30 分鐘。 

4、用預冷PBS溶液洗滌細胞，300 -400 g離心5分鐘，去上清。

5、用3倍體積的固定/破膜稀釋液 稀釋 固定/破膜濃縮液，制成固定/破膜工作液，注意要新鮮配制，每個樣本的用量為1ml。

6、旋渦震蕩重懸細胞后加入1ml的固定/破膜工作液（Fixation/Permeabilization）（1:3稀釋好），并再次旋渦混勻。

7、避光4℃孵育30分鐘到60分鐘。

8、將破膜緩沖液用去離子水1:9稀釋，制成工作液。每個樣本的用量為4~5ml。

9、無需洗滌，直接加入2ml 破膜緩沖液（Permeabilization Buffer）300 -400 g離心洗滌細胞并棄去上清液。

10、（可選）重復第9步操作洗滌細胞。

11、加入100 ul PBS重懸細胞。

12、（封閉可選）體系中加入2%的大鼠血清2 ul，室溫避光孵育30分鐘。

13、體系加入適量的Foxp3抗體，對照管中加入適量的同型對照，具體用量參照說明書，避光4℃孵育至少30分鐘。建議進行預實驗摸索出抗體的最適濃度。

14、加入2ml破膜工作液離心洗滌細胞并棄去上清液。

15、重復上一步洗滌細胞。

16、用適量體積的Flow Cytometry Staining Buffer重懸細胞，并上機檢測并分析。注：由于染色過程中使用了細胞固定和破膜，對比起活細胞在形態上會有一定變化，因此FSC/SSC圖中圈門時需要做一定調整。                 

注：以上說明書僅供參考，具體實驗請對照廠商說明書操作。