miRNA qPCR Detection Primer Set（miRNA檢測試劑盒）實驗說明

瀏覽次數(shù)：8169　發(fā)布日期：2010-11-16　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責任自負

一、概述

1、介紹
microRNA(miRNA)是一類有大約22 個核苷酸組成的非編碼小分子RNA，其廣泛存在于真核生物中。miRNA 在個體發(fā)育的不同時期及不同組織中有不同的表達模式，都表明了其在發(fā)育和分化中起有重大的調(diào)控作用。迄今為此，對miRNA 的檢測方法主要有Northern Blot 等基于分子雜交的方法，這些方法敏感度低、耗時長、RNA 的用量較大。miRNA Q-PCR etection Kit采用了國際上公認的核酸檢測標準技術(shù)――Real-Time PCR 技術(shù)來對miRNA 進行檢測，其具有快速、特異性強、靈敏度高等優(yōu)點。

2、實驗原理
EzOmicsTM miRNA qPCR Detection Primer Set包含了miRNA特異的逆轉(zhuǎn)錄引物，以及qPCR正、反向引物套裝。其中莖凸環(huán)結(jié)構(gòu)狀的miRNA特異逆轉(zhuǎn)錄引物可特異性的轉(zhuǎn)錄成熟的miRNA。再利用高度特異的正反向引物，使miRNA定量即靈敏又高度特異。
EzOmicsTM miRNA qPCR Detection Primer Set提供了一種最低能檢測到5個拷貝目標miRNA的高靈敏度的檢測方法，并且具有一個7 個數(shù)量級的動態(tài)變化范圍，反應(yīng)的模板可以是總RNA或者已純化的小RNA等。

3、產(chǎn)品內(nèi)容

名稱	介紹	量
RT Primer	miRNA Reverse Transcription Primer	2 nmol
Forward Primer	miRNA Forward Primer	2 nmol
Revers Primer	Universal Reverse Primer	2 nmol

二、實驗準備

1、客戶需自己提供實驗試劑
一步法或兩步法qPCR mix，反轉(zhuǎn)錄酶，RNA 酶抑制劑，DEPC-H2O 等

2、耗材準備
無RNase，DNase 的吸頭，離心管等

3、引物準備
引物為干粉形式，需先離心，后每管加入200 μL DEPC-H2O稀
釋至10μM，混勻后于-20oC凍存?zhèn)溆?/FONT>

4、儀器準備
離心機、實時熒光定量PCR 儀等

三、實驗步驟
1．兩步法擴增
先將miRNA做反轉(zhuǎn)錄miRNA cDNA，然后再進行qPCR定量

1.1 RT Primer Mix的配置
EzOmicsTM miRNA qPCR Detection Primer Set可以同時檢測50個以內(nèi)的miRNA分子。反轉(zhuǎn)錄之前，需預先配置RT Primer Mix(200nM)。如果需要用5S rRNA 或U6 snRNA 做內(nèi)參對照，需同時配置Random Primer或內(nèi)參的Reverse Prime做反轉(zhuǎn)錄引物。

1.2 逆轉(zhuǎn)錄體系

試劑	體積	終濃度
RNA模板	0.2ng~1μg	根據(jù)實驗需求
RT Primer Mix	5 μl	20nM
10×RT Buffer	5 μl	1×
RNase inhibitor	見試劑供應(yīng)商說明書
dNTP (2.5mM)	4 μl	200nM
逆轉(zhuǎn)錄酶	見試劑供應(yīng)商說明書
DEPC-H2O	補足至50μl