限制酶使用說明
| 一、分類 | |||||||||||||||||
| 目前，已被發現的限制酶，根據其反應的必須因子和切斷點等特性，被分為以下三大類： | |||||||||||||||||
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| 應用于基因工程研究用的限制酶，一般全是II類酶，現在市場上銷售的酶都屬于II類酶, 這些限制酶由于其反應條件和底物DNA種類的不同，其切斷狀況及出現Star活性的頻率等各有不同，并且其程度也根據酶的不同而千差萬別。因而在使用限制酶時，必須對這些要素充分注意，確保目標序列的切斷反應能順利進行，下面具體介紹一下使用限制酶時的一些注意點。 | |||||||||||||||||
| 二、注意事項 | |||||||||||||||||
| 1. 甲基化的影響 | |||||||||||||||||
| 從帶有DNA甲基化酶基因的宿主菌中制備的DNA，其堿基的一部分已經被甲基化，因此即便使用能夠識別、切斷被甲基化部分的序列的限制酶，也幾乎無法切斷被甲基化的部分。被甲基化的部位，根據底物DNA及宿主種類的不同而不同。例如宿主菌為大腸桿菌的情況下，根據宿主的種類有以下兩種情況： | |||||||||||||||||
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| 在進行轉化時，通常使用的菌株為C600、HB101、JM109等，因為都帶有dam、dcm甲基化酶，所以使用這些菌株制備的DNA時，必須注意。另外，動物由來的DNA，CG序列多為5mCG；植物由來的DNA，CG及CNG序列多為5mCG和5mCNG。 | |||||||||||||||||
| 2. Star活性 | |||||||||||||||||
| 限制酶在一些特定條件下使用時，對于底物DNA的特異性可能降低。即可以把與原來識別的特定的DNA序列不同的堿基序列切斷，這個現象叫Star活性。Star活性出現的頻率，根據酶、底物DNA、反應條件的不同而不同，可以說幾乎所有的限制酶都具有Star活性。并且，它們除了識別序列的范圍增大之外，還發現了在DNA的一條鏈上加入切口的單鏈切口活性，所以為了極力抑制Star活性，一般情況下，即使會降低反應性能，我們也提倡在低甘油濃度、中性pH、高鹽濃度條件下進行反應。 | |||||||||||||||||
| 3. 部分分解 | |||||||||||||||||
| 如果使用預計的限制酶對底物DNA進行作用，而未能完全將其切斷，其原因除了上述兩點和酶失活之外，DNA的純度、反應阻害物的影響、DNA的種類等也有關系。特別是由于DNA種類不同，它們的大小、切點數也不同，達到完全分解時，所需要的酶量也不同，從這些數據中計算出的 [完全分解1 μg DNA所需要的限制酶預計量] 與 [實際量]，也因限制酶的種類不同而有差別，這些差別被認為是酶同其識別位點周圍的高級結構親和程度而產生的。例如， 限制酶Nae I 在切斷pBR322 DNA時，就有著非常難以切斷的部位。另外，因反應液組成變化 (如添加精脒)，也可以使切斷順序發生變化。 | |||||||||||||||||
| 4. DNA結合物質 | |||||||||||||||||
| 限制酶切反應后進行電泳時，有時會發生電泳帶無法確認、電泳帶擴散、電泳帶移動距離異常等問題，這是由于酶蛋白自身或其它雜蛋白與DNA結合在一起，使DNA沒有進入電泳凝膠中，或DNA難以被溴乙錠染色而造成的。發生這些現象時，在試樣中加入一些蛋白質變性劑 (如SDS，終濃度0.1%左右)，便可改善電泳效果。 | |||||||||||||||||
| 5. 其它 | |||||||||||||||||
| 限制酶的保質期一般是在檢定日以后的三年內，但幾乎所有的限制酶在超過保質期后都不會急劇失活，因此購入后即使是經過長時間保存的酶，也完全可以使用，但這些酶在使用前最好再測一次活性。另外，保存酶時即便讓其凍結，大部分酶也不會急劇失活。 | |||||||||||||||||
| 三、活性定義 | |||||||||||||||||
| 限制酶的一個活性單位 (1 U)，原則上是在50 μl的反應液中，37℃的溫度條件下，經過1小時反應，將1 μg DNA完全分解所需要的酶量。關于測定活性用的底物DNA以及溫度，在后面的資料中對每種酶都做了詳細介紹。此外酶在其它通用緩沖液中的相對活性，在附表中也有總括記載。 | |||||||||||||||||
| 四、純度檢定 | |||||||||||||||||
| 每個批號的酶基本上都要進行下列項目的檢測： | |||||||||||||||||
| 1. 過剩量酶反應檢定 | |||||||||||||||||
| 在1 μg底物DNA(通常用λDNA)中加入過量的限制酶，反應24小時，然后進行瓊脂糖電泳，根據電泳圖譜，判斷酶中是否夾雜有非特異性核酸酶。 | |||||||||||||||||
| 2. 基因組DNA分析 | |||||||||||||||||
| 對指定的限制酶(在酶的分項介紹中標明)進行該項檢測。在適當的細菌DNA底物中 (瓊脂糖凝膠塊中的DNA濃度為0.5 μg/50 μl)加入20～150 U的限制酶，反應24小時，然后進行瓊脂糖電泳，根據電泳圖譜，確認酶中是否含有雜質。 | |||||||||||||||||
| 3. 連接—再切檢定 | |||||||||||||||||
| 把底物DNA首先與2~50倍過量的酶反應， 然后回收切斷后的DNA，把它溶解于T4 DNA連接酶的緩沖液中 [66 mM Tris-HCI (pH7.6)，6.6 mM MgCl2，10 mM DTT，0.4 mM ATP] 使其5’ 末端濃度成為0.1~1.0 μM，加入適量的T4 DNA連接酶， 在16℃下反應1小時或16~18小時，再回收DNA后，把它溶解于限制酶反應液中，用同樣的限制酶再進行切斷反應。通過以上的實驗結果，可以判斷是否存在連接酶抑制劑或磷酸酶以及核酸外切酶等雜質。 | |||||||||||||||||
| 4. pKF3克隆檢測 | |||||||||||||||||
| 對于在強制克隆載體pKF3 DNA的多克隆位點上有一個切斷點的限制酶，可以進行該項檢測。用10倍過量的被檢測的限制酶對pKF3 DNA進行作用，失活處理后，將已切斷的DNA用DNA連接試劑盒在16℃、30 min的條件下進行反應，將該反應液的一部分轉化到TH2感受態細胞中，用兩種培養基 (LB-Cm-Sm、LB-Cm) 在37℃的條件下培養兩個晚上，根據LB-Cm-Sm培養基上是否出現菌落，來判斷限制酶中是否含有極其微量的核酸外切酶。 | |||||||||||||||||
| 五、甲基化的影響 | |||||||||||||||||
| 如果限制酶識別序列中的堿基被甲基化，則根據被甲基化堿基的種類及位置的不同，有時會發生該DNA切不開的現象。 | |||||||||||||||||
| 大多數大腸桿菌都帶有2種具有特異性識別位點的甲基化酶，即dam methylase (G6mATC) 和dcm methylase (C5mCWGG)， 因此，從這些大腸桿菌中提取的DNA，該序列一般被甲基化。 另外，哺乳類由來的DNA，大多受CG methylase ( 5mCG) 的影響而被甲基化。 | |||||||||||||||||
| 受dam methylase、dcm methylase、CG methylase影響的限制酶，在酶的單項介紹中都做了提示，希望在使用中加以注意。 | |||||||||||||||||
| 六、Star活性 | |||||||||||||||||
| 限制酶根據反應條件的不同，可能會切斷與原來認識序列不同的位點， 這種不同于原有的特異性的活性，稱為Star活性，在各種酶的分項介紹中，我們將容易產生Star活性的酶，以及產生的條件做了注明。 | |||||||||||||||||
| 七、雙酶切反應 | |||||||||||||||||
| 使用兩種酶同時進行DNA切斷反應 (Double Digestion)，是實驗操作中常用的手段之一。此時，使用Buffer非常重要。在"Double Digestion(雙酶切反應)時Universal Buffer(通用緩沖液)的使用表 "中，介紹了雙酶切反應的Buffer系統，供實驗參考之用。 | |||||||||||||||||
| 八、PCR片段末端的限制酶切斷 | |||||||||||||||||
| PCR片段經酶切后克隆于載體中是經常使用的實驗方法。但實驗證明，大多數限制酶對裸露的酶切位點不能切斷。在"PCR產物末端限制酶切位點的切斷情況 "中，介紹了PCR片段末端的限制酶切斷情況。 | |||||||||||||||||
| 九、限制酶末端的相互連接 | |||||||||||||||||
| 盡管限制酶不同，但只要酶切后產生的切口序列相互吻合，就可以進行相互連接。"有關Ligation和Recutting的限制酶一覽表 "中羅列了這些限制酶的相互關系，對選擇用于切斷－連接的限制酶很有用處。 | |||||||||||||||||
| 十、保存溫度 | |||||||||||||||||
| -20℃下保存。 |
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