譜系示蹤系列第二期之單重組酶介導的多色報告系統方法
細胞譜系追蹤技術通常是指使用各種手段對某類祖細胞亞群進行標記，在后續時間點對其分化命運進行檢測，它對于揭開多樣的、基礎的生物學過程中的分子機制是非常關鍵，因此一直以來建立能夠在體內進行追蹤細胞譜系的動物模型是生物學研究的一個長期目標。
根據重組類型和數量，基因重組系統可以分為傳統的單重組酶介導的遺傳方法與更復雜的單重組酶介導的多色報告系統方法和多重組酶介導的遺傳方法，本期鼠博士為大家講解單重組酶介導的多色報告系統。
上期推文：【譜系示蹤系列第一期】基礎細胞標記方式
單重組酶介導的單色報告基因就是最基礎的使用Cre-loxp系統進行譜系示蹤，該技術的關鍵在于評估驅動Cre的啟動子的表達位置。而Cre-loxP系統的多色報告基因可用于單細胞標記和克隆分析，為單細胞增殖、分化后的命運提供了有價值的信息。這種報告系統也被稱之為“Brainbow”系統。
在 Brainbow 系統中，Cre/lox重組可在三種或更多熒光蛋白（XFP）之間隨機選擇表達，從而提供了一種區分相鄰神經元和可視化其他細胞相互作用的方法。根據lox 位點不同還可以分為Brainbow-1 與Brainbow-2。
Brainbow-1
Brainbow-1是在報告基因之間加入成對的不同的 lox 位點，通過 Cre 介導的切除實現不同的基因重組。
lox位點是一個34bp的序列，由兩個13bp的反向回文重復序列和8bp的中間間隔序列組成：ATAACTTCATGTA-NNNTANNN-TATACGAAGTTAT。N表示可變堿基，不同的堿基選擇可形成不同的Lox位點，除了野生型loxP，常見的還有Lox2272，Lox511，Lox5171等。在Cre酶的作用下，Lox變體不會與經典 loxP發生重組，但可以與相同的Lox變體發生重組。
利用這一特性，Brainbow-1通過在同一結構中交替使用變異 lox 位點和經典 loxP位點，cre酶會在任意一對相同的lox位點之間進行切除，同時去除另一對位點中的一個，從而防止進一步的重組。
案例1
當無Cre酶表達時：
1 該系統按照啟動子的方向，表達紅色熒光RFP。RFP序列后的Poly A（圖示為pA）會介導基因停止表達，后續的元件均不表達，因而細胞呈現紅色。
當Cre酶表達時，該系統會出現兩種可能發生的情況：
1 序列中存在兩個同向的loxP位點（圖中黑色三角形），Cre酶會切除兩個loxP位點之間的序列（紅色熒光RFP序列被切除）。之后，該系統按照啟動子的方向，表達黃色熒光YFP。YFP序列后的Poly A（圖示為pA）會介導基因停止表達，后續的元件均不表達，因而細胞呈現黃色。
2 序列中存在兩個同向的lox2272位點（圖中斜條紋三角形），Cre酶會切除兩個lox2272位點之間的序列（紅色熒光RFP序列與黃色熒光YFP序列被切除）。之后，該系統按照啟動子的方向，表達藍色熒光M-CFP，因而細胞呈現藍色。
因此，細胞可能存在三種顏色：紅色（cre未表達）；黃色、藍色（cre表達）
案例2
當無Cre酶表達時：
1 該系統按照啟動子的方向，表達橙色熒光OFP。OFP序列后的Poly A（圖示為pA）會介導基因停止表達，后續的元件均不表達，因而細胞呈現橙色。
當Cre酶表達時，該系統會出現三種可能發生的情況：
1 序列中存在兩個同向的loxN位點（圖中斑點色三角形），Cre酶會切除兩個loxN位點之間的序列（橙色熒光OFP序列被切除）。之后，該系統按照啟動子的方向，表達紅色熒光M-RFP。M-RFP序列后的Poly A（圖示為pA）會介導基因停止表達，后續的元件均不表達，因而細胞呈現紅色。
2 序列中存在兩個同向的lox2272位點（圖中斜條紋三角形），Cre酶會切除兩個lox2272位點之間的序列（橙色熒光OFP序列與紅色熒光M-RFP序列被切除）。之后，該系統按照啟動子的方向，表達黃色熒光M-YFP，M-YFP序列后的Poly A（圖示為pA）會介導基因停止表達，后續的元件均不表達，因而細胞呈現黃色。
3 序列中存在兩個同向的loxP位點（圖中黑色三角形），Cre酶會切除兩個loxP位點之間的序列（橙色熒光OFP序列、紅色熒光M-RFP序列與黃色熒光M-YFP序列被切除）。之后，該系統按照啟動子的方向，表達藍色熒光M-CFP，因而細胞呈現藍色。
因此，細胞可能存在三種顏色：橙色（cre未表達）；紅色、黃色、藍色（cre表達）。
Brainbow-2
在 Brainbow-2 中，存在一對或多對的相反方向的loxP 位點，這些相反的方向loxP 位點分隔多個報告基因的序列。
當兩個loxP為反向時，Cre 可以倒轉中間的報告基因的序列，從而產生多個重組結果。只要重組酶存在，倒轉就可以持續。而通過限制cre酶的活性時間，就可以實現細胞中基因的穩定重組。
案例1
當無Cre酶表達時：
1 該系統按照啟動子的方向，表達紅色熒光RFP。RFP序列后的Poly A（圖示為pA）會介導基因停止表達，后續的元件均不表達，因而細胞呈現紅色。
當Cre酶表達時，序列中存在一對反向的loxP位點（圖中黑色三角形），Cre 可以倒轉兩個loxP位點之間的序列，該系統會出現兩種可能發生的情況：
1 倒轉發生奇數次。該系統按照啟動子的方向，表達藍色熒光M-CFP。M-CFP序列后的Poly A（圖示為pA）會介導基因停止表達，后續的元件均不表達，因而細胞呈現藍色。
2 倒轉發生偶數次。該系統按照啟動子的方向，表達紅色熒光RFP。RFP序列后的Poly A（圖示為pA）會介導基因停止表達，后續的元件均不表達，因而細胞呈現紅色。
因此，細胞可能存在兩種顏色：紅色（cre未表達）；紅色、藍色（cre表達）。
案例2
當無Cre酶表達時：
1 該系統按照啟動子的方向，表達綠色熒光nGFP。nGFP序列后的Poly A（圖示為pA）會介導基因停止表達，后續的元件均不表達，因而細胞呈現綠色。
當Cre酶表達時，該系統會出現四種可能發生的情況：
a. LoxP位點①與③為同向，Cre酶切除①與③位點之間的序列（綠色熒光nGFP序列與黃色熒光YFP序列被切除），并介導反向的loxP位點③與④之間進行倒轉：
1 倒轉發生奇數次。該系統按照啟動子的方向，表達藍色熒光M-CFP。M-CFP序列后的Poly A（圖示為pA）會介導基因停止表達，后續的元件均不表達，因而細胞呈現藍色。
2 倒轉發生偶數次。該系統按照啟動子的方向，表達紅色熒光RFP。RFP序列后的Poly A（圖示為pA）會介導基因停止表達，后續的元件均不表達，因而細胞呈現紅色。
b. loxP位點②與④為同向，Cre酶切除②與④位點之間的序列（紅色熒光RFP序列與藍色熒光M-CFP序列被切除），并介導反向的loxP位點①與②之間進行倒轉：
3 倒轉發生偶數次。該系統按照啟動子的方向，表達綠色熒光nGFP。nGFP序列后的Poly A（圖示為pA）會介導基因停止表達，后續的元件均不表達，因而細胞呈現綠色。
4 倒轉發生奇數次。該系統按照啟動子的方向，表達黃色熒光YFP。YFP序列后的Poly A（圖示為pA）會介導基因停止表達，后續的元件均不表達，因而細胞呈現黃色。
因此，細胞可能存在四種顏色：綠色（cre未表達）；藍色、紅色、綠色、藍色（cre表達）。
使用 Brainbow系統對小鼠特定組織的單細胞進行標記后，即可根據顏色對終點細胞進行分組，從而實現單細胞水平的譜系譜系示蹤。
上述單重組酶報告基因系統只能依賴一個Maker來定位我們的目的細胞，但隨著細胞分類的不斷深入，我們往往需要兩個甚至兩個以上的Maker才能準確定位我們想要研究的細胞群體，這時標記細胞就需要使用到多重組酶介導的遺傳方法，下一期鼠博士為大家講解多重組酶介導的多色報告系統。
Reference：
[1] Livet, J., Weissman, T., Kang, H. et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature 450, 56–62 (2007). https://doi.org/10.1038/nature06293
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