對抗耐藥菌新利器—毛細(xì)管波微生物反應(yīng)器革新噬菌體篩選技術(shù)
瀏覽次數(shù):135 發(fā)布日期:2025-6-12
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對抗耐藥菌新利器:毛細(xì)管波微生物反應(yīng)器革新噬菌體篩選技術(shù)
——PipeJet 納升級微量分液模塊助力噬菌體療法研究
在抗生素過度使用的當(dāng)下,多重耐藥病原菌數(shù)量不斷攀升,嚴(yán)重威脅人類健康。噬菌體療法憑借高度特異性,成為極具潛力的治療選擇。然而,傳統(tǒng)的噬菌體篩選方法,如在雙層瓊脂平板上進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和噬菌體添加以引發(fā)細(xì)菌裂解,不僅操作繁瑣、工作量大,而且難以實(shí)現(xiàn)并行化和自動(dòng)化,嚴(yán)重限制了篩選效率。在此背景下,開發(fā)一種高效、快速且能實(shí)現(xiàn)高通量篩選的方法至關(guān)重要,不僅能加速噬菌體療法的臨床應(yīng)用,還可能為耐藥菌感染帶來新的突破。
本次介紹的文章是《PhagoScreener: A novel phagogram platform based on a capillary-wave microbioreactor》,來自德國布倫瑞克工業(yè)大學(xué)生物化學(xué)工程研究所的研究團(tuán)隊(duì),于2024年發(fā)表在《New BIOTECHNOLOGY》雜志。該團(tuán)隊(duì)建立了一套新的基于毛細(xì)管波微生物反應(yīng)器(capillary-wave microbioreactor ,cwMBR)的噬菌體篩選技術(shù),有望加速噬菌體研究的臨床應(yīng)用。
實(shí)驗(yàn)步驟
- 1.菌株與噬菌體準(zhǔn)備:大腸桿菌K12 MG1655在復(fù)合培養(yǎng)基中搖瓶過夜培養(yǎng)作為預(yù)培養(yǎng)物。噬菌體 MM02和EASG3分別用噬菌體緩沖液復(fù)蘇后進(jìn)行直接的噬斑測定,以確定噬菌體滴度,并制備初級、次級裂解液備用。
- 2.cwMBR 平臺(tái)搭建:cwMBR 芯片由飛秒激光直寫結(jié)合選擇性濕法蝕刻光敏玻璃制成,繼而置于 3D 打印的平臺(tái)支架中。支架由方形聚氯乙烯板和電子激勵(lì)器組成。將整體平臺(tái)放入連接恒溫器和超聲波加濕器的培養(yǎng)箱內(nèi),通過垂直振蕩技術(shù)混合液滴產(chǎn)生特定波型的毛細(xì)管波,以微渦流的形式引起對流,通過相關(guān)軟件、聲卡和放大器驅(qū)動(dòng),藍(lán)色 LED 用作吸光度測量的光源。
圖 1. cwMBR 平臺(tái):3D 打印的cwMBR支架、cwMBR芯片及其他組件
支架底座最多可包含 9 個(gè)入口,每個(gè)入口容納 1 個(gè) cwMBR 芯片。入口將 cwMBR 和光纖固定在適當(dāng)?shù)奈恢茫员銈鞲衅髯x出;蓋子和濕潤的海綿可最大限度地減少 cwMBR 芯片的蒸發(fā);藍(lán)色 LED 用作吸光度測量的光源。
- 3.Biofluidix 相關(guān)操作:使用德國 BioFluidix公司開發(fā)的 PipeJet Nanodispenser 納升級微量分液模塊評估吸光度傳感器系統(tǒng)對微生物培養(yǎng)液濃度測量的適用性。先向 cwMBR 芯片半填充 3.5 μL 氯化鈉溶液,再用PipeJet納升級微量分液模塊以 0.5 μL 的增量添加濃縮大腸桿菌培養(yǎng)物(OD≈16)直至體積達(dá) 7 μL,測定每步添加后的電路電壓,建立電壓與細(xì)胞濃度關(guān)系。
- 4.培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)與噬菌體篩選:分別在 cwMBR 和 96 孔板中培養(yǎng)大腸桿菌并對比,同時(shí)進(jìn)行噬菌體篩選實(shí)驗(yàn)。將預(yù)培養(yǎng)的大腸桿菌稀釋后,7 μL 用PipeJet納升級微量分液模塊加入 cwMBR,100 μL 加入 96 孔板。cwMBR 培養(yǎng)時(shí)控制溫度、濕度和振蕩條件,96 孔板在酶標(biāo)儀中培養(yǎng),設(shè)置振蕩和不振蕩組,定期測量吸光度和細(xì)胞計(jì)數(shù)。噬菌體篩選實(shí)驗(yàn)中,大腸桿菌培養(yǎng)至特定光密度后添加不同濃度的噬菌體,設(shè)置生長對照,同步培養(yǎng)并測量。
- 5.統(tǒng)計(jì)分析:所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)重復(fù),采用單因素方差分析判斷不同噬菌體、噬菌體感染復(fù)數(shù)(MOI)或培養(yǎng)系統(tǒng)對最終細(xì)胞數(shù)量的影響。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
- 1.傳感器系統(tǒng)性能良好:開發(fā)的基于光電阻的吸光度傳感器系統(tǒng)成本效益高、可高度并行化,測量結(jié)果與細(xì)胞濃度在一定范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系(R2 = 95.0%),適用于噬菌體篩選及其他細(xì)胞相關(guān)應(yīng)用(圖2)。
圖 2 . 基于 Arduino 的吸光度傳感器系統(tǒng)在不同光密度(λ=600nm,范圍為 0 至 8.32)和細(xì)胞數(shù)量(范圍為 0 至 4.23×109 mL-1 )下相對于 OD=0 的電壓變化此圖展示了毛細(xì)管波微生物反應(yīng)器(cwMBR)芯片中的數(shù)據(jù)情況。
- 2.cwMBR 培養(yǎng)優(yōu)勢顯著:cwMBR 與振蕩的 96 孔板培養(yǎng)效果相似且優(yōu)于非振蕩的 96 孔板。cwMBR 中大腸桿菌生長良好,細(xì)胞密度和生長速率較高。其親水性玻璃表面減少噬菌體吸附,芯片可重復(fù)使用,且未來可高度并行化和自動(dòng)化。
- 3.適用于不同噬菌體篩選:cwMBR 適用于不同噬菌體如MM02 和 EASG3的篩選,可區(qū)分其裂解動(dòng)力學(xué)差異,同時(shí)在線裂解測量可加速噬菌體篩選過程,未來有望用于高通量篩選和個(gè)性化醫(yī)療。
綜上所述,cwMBR 為噬菌體篩選提供了一種經(jīng)濟(jì)、高效的替代方案,快速生成噬菌體篩選結(jié)果。結(jié)合液體處理系統(tǒng)德國BioFluidix公司的PipeJet Nanodispenser 納升級微量分液模塊,cwMBR 的并行化能力有效提升,可快速篩選大量噬菌體庫以及噬菌體 - 噬菌體、噬菌體 - 抗生素組合,為個(gè)性化醫(yī)療中的噬菌體療法乃至其他應(yīng)用(如抗生素敏感性測試)提供有力支持。后續(xù)研究將針對臨床更相關(guān)的微生物開展噬菌體篩選實(shí)驗(yàn),并探索其最佳初始細(xì)胞濃度,進(jìn)一步拓展 cwMBR 的應(yīng)用潛力。
更多信息請參考原文:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1871678424005363
Biofluidix是全球領(lǐng)先的研發(fā)制造高精度生物芯片點(diǎn)樣和分液系統(tǒng)的生產(chǎn)廠家,不僅有體系化的點(diǎn)樣分液平臺(tái),也提供模塊化的皮升、納升和微升分液裝置,能夠兼容第三方設(shè)備,實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)點(diǎn)樣和分液。廣泛應(yīng)用與生物、材料、航空、航天等多個(gè)領(lǐng)域。
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