中喬新舟bEnd.3細胞培養技術流程和技巧
bEnd.3細胞 (小鼠腦微血管內皮細胞)是從來自患有內皮瘤的小鼠腦組織中分離的內皮細胞，該細胞通過表達多瘤病毒中間T抗原的NTKmT逆轉錄病毒載體感染而轉化。在培養時，bEnd.3細胞最常遇到的問題就是細胞形態變化和難消化。bEnd.3細胞本身生長較慢，在低密度時會呈現不規則細胞形態，高密度時則呈規則纖維狀，所以若在培養過程中發現細胞形態異常，則有可能是細胞密度低，建議細胞鋪滿密度較高時傳代。
一、細胞特性與培養價值
作為小鼠腦微血管內皮細胞系，bEND.3細胞因其穩定的屏障功能表達（如緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-5）和低傳代變異率，成為血腦屏障研究的首選模型。其典型特征包括：
1）梭形或多邊形：在低密度培養時，bEND.3 細胞通常呈現梭形或稍長的形態，隨著細胞增殖和鋪展，形態趨于多邊形。
2）多邊形鵝卵石樣排列：當細胞生長到融合狀態（高密度≥80%）時，bEND.3 細胞緊密連接，形成類似“鵝卵石”狀的單層結構，這是內皮細胞的典型特征。
3）細胞邊界清晰：在單層培養時，細胞之間的連接較為緊密，可形成血腦屏障相關特性。
4）細胞核居中：bEND.3 細胞的細胞核一般位于中央，形態較圓，核染色質分布均勻。
5）貼壁生長：作為內皮細胞，bEND.3 細胞主要依賴貼壁培養，其形態隨培養密度不同而變化。
以下是不同倍數下的細胞形態圖：
中喬新舟細胞培養圖4x
中喬新舟細胞培養圖10x
中喬新舟細胞培養圖20x
作為腦微血管內皮細胞模型的黃金標準，bEND.3細胞的穩定培養需要這些核心技巧：
二、標準化培養流程
1. 培養前準備
培養基配置
· 基礎液：DMEM高糖（貨號：ZQ-100）+10%胎牛血清（貨號：ZQ0500）+1%雙抗（貨號：CSP006），或用推薦的完全培養基（貨號：ZM0090），每2-3天換液（密度<80%時），預熱培養基至37℃可減少細胞應激
bEnd.3細胞專用培養基已包含成分包含基礎培養基、血清、雙抗等細胞生長需要的其他添加物。由中喬新舟技術團隊精心優化，經過長期測試，可保持細胞良好的生長狀態。
· 注意：每批次血清需進行生長曲線測試（推薦接種1×10⁴/cm²，72小時應達80%匯合）
耗材處理
· 培養瓶預包被：0.1%明膠（37℃孵育1小時）可提升初期貼壁率30%
2. 復蘇與傳代
復蘇關鍵步驟
① 快速水浴（37℃/60秒）至冰晶殘留＜10%
② 離心（800rpm/3min）去除DMSO
③ 重懸接種密度≥5×10⁴/cm²（首次換液延至24小時后）
傳代標準化
· 消化控制：0.05%胰酶室溫消化45-60秒，鏡下見細胞間隙擴大即終止
· 終止技巧：加入含血清培養基后靜置2分鐘再吹打（減少機械損傷）
· 傳代比例：接種密度建議1×10⁴/cm²，1:3至1:4（維持24-36小時對數生長期），傳代后6小時內避免移動培養瓶
三、典型問題與解決方案
1）細胞形態異常與分化
1. 復蘇后分叉或碎片多
凍存/復蘇損傷導致形態不規則：改用無血清凍存液減少冰晶損傷，復蘇時37℃水浴時間控制在90秒內。
增加復蘇后培養基血清濃度至15%-20%，緩沖細胞損傷。
2. 傳代后形態改變
胰酶消化嚴格控制在1-2分鐘，顯微鏡下80%細胞變圓立即終止（過度消化破壞細胞連接）。
傳代后24小時內補充高血清培養基（15% FBS）促進貼壁修復。
2）消化與傳代困難
1. 細胞難脫落
使用含EDTA的胰酶（0.25%胰酶+0.53mM EDTA）24，消化前用PBS充分沖洗去除血清殘留。
培養超過30代后消化時間延長：分次消化（每次≤3分鐘）。
2. 傳代后生長停滯
排查血清活性（建議每批次預實驗）或是否支原體污染
確認CO₂濃度穩定在5%，培養基pH維持在7.2-7.4。
3）出現黑色顆粒物
通常為代謝產物，需增加換液頻率（48小時/次）
4）傳代后貼壁延遲
可能的原因：血清批次差異或消化損傷
解決方案：接種后6小時內不移動培養瓶，可添加10μg/ml纖連蛋白
5）自發分化
表現：出現梭形細胞
解決方案：嚴格篩選匯合度（傳代前需達90%但不超過24小時）
6）細胞突然收縮脫落
檢查CO₂濃度（5%最佳）和培養基pH（7.2-7.4）
7）凍存與復蘇缺陷
1. 復蘇碎片過多
離心速度限定1000rpm（約150×g）5分鐘，高速離心加劇碎片產生。
凍存細胞密度建議為1×10⁶~5×10⁶/mL。
2. 存活率低
干冰運輸后需立即37℃快速復蘇，延遲操作導致冰晶二次損傷。
凍存液避免含血清，改用專用無血清配方。
8）污染與培養基問題
1. 隱污染風險
傳代時添加1%雙抗（青霉素-鏈霉素），但連續使用不超過3代，避免掩蓋污染。
2. 培養基失效
基礎配方：DMEM＋10% FBS＋1%雙抗，血清批次需預測試（不同批次生長差異可達30%）。
換液頻率：48-72小時/次，避免代謝廢物堆積。
一、細胞特性與培養價值
作為小鼠腦微血管內皮細胞系，bEND.3細胞因其穩定的屏障功能表達（如緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-5）和低傳代變異率，成為血腦屏障研究的首選模型。其典型特征包括：
1）梭形或多邊形：在低密度培養時，bEND.3 細胞通常呈現梭形或稍長的形態，隨著細胞增殖和鋪展，形態趨于多邊形。
2）多邊形鵝卵石樣排列：當細胞生長到融合狀態（高密度≥80%）時，bEND.3 細胞緊密連接，形成類似“鵝卵石”狀的單層結構，這是內皮細胞的典型特征。
3）細胞邊界清晰：在單層培養時，細胞之間的連接較為緊密，可形成血腦屏障相關特性。
4）細胞核居中：bEND.3 細胞的細胞核一般位于中央，形態較圓，核染色質分布均勻。
5）貼壁生長：作為內皮細胞，bEND.3 細胞主要依賴貼壁培養，其形態隨培養密度不同而變化。
以下是不同倍數下的細胞形態圖：
中喬新舟細胞培養圖4x
中喬新舟細胞培養圖10x
中喬新舟細胞培養圖20x
作為腦微血管內皮細胞模型的黃金標準，bEND.3細胞的穩定培養需要這些核心技巧：
二、標準化培養流程
1. 培養前準備
培養基配置
· 基礎液：DMEM高糖（貨號：ZQ-100）+10%胎牛血清（貨號：ZQ0500）+1%雙抗（貨號：CSP006），或用推薦的完全培養基（貨號：ZM0090），每2-3天換液（密度<80%時），預熱培養基至37℃可減少細胞應激
bEnd.3細胞專用培養基已包含成分包含基礎培養基、血清、雙抗等細胞生長需要的其他添加物。由中喬新舟技術團隊精心優化，經過長期測試，可保持細胞良好的生長狀態。
· 注意：每批次血清需進行生長曲線測試（推薦接種1×10⁴/cm²，72小時應達80%匯合）
耗材處理
· 培養瓶預包被：0.1%明膠（37℃孵育1小時）可提升初期貼壁率30%
2. 復蘇與傳代
復蘇關鍵步驟
① 快速水浴（37℃/60秒）至冰晶殘留＜10%
② 離心（800rpm/3min）去除DMSO
③ 重懸接種密度≥5×10⁴/cm²（首次換液延至24小時后）
傳代標準化
· 消化控制：0.05%胰酶室溫消化45-60秒，鏡下見細胞間隙擴大即終止
· 終止技巧：加入含血清培養基后靜置2分鐘再吹打（減少機械損傷）
· 傳代比例：接種密度建議1×10⁴/cm²，1:3至1:4（維持24-36小時對數生長期），傳代后6小時內避免移動培養瓶
三、典型問題與解決方案
1）細胞形態異常與分化
1. 復蘇后分叉或碎片多
凍存/復蘇損傷導致形態不規則：改用無血清凍存液減少冰晶損傷，復蘇時37℃水浴時間控制在90秒內。
增加復蘇后培養基血清濃度至15%-20%，緩沖細胞損傷。
2. 傳代后形態改變
胰酶消化嚴格控制在1-2分鐘，顯微鏡下80%細胞變圓立即終止（過度消化破壞細胞連接）。
傳代后24小時內補充高血清培養基（15% FBS）促進貼壁修復。
2）消化與傳代困難
1. 細胞難脫落
使用含EDTA的胰酶（0.25%胰酶+0.53mM EDTA）24，消化前用PBS充分沖洗去除血清殘留。
培養超過30代后消化時間延長：分次消化（每次≤3分鐘）。
2. 傳代后生長停滯
排查血清活性（建議每批次預實驗）或是否支原體污染
確認CO₂濃度穩定在5%，培養基pH維持在7.2-7.4。
3）出現黑色顆粒物
通常為代謝產物，需增加換液頻率（48小時/次）
4）傳代后貼壁延遲
可能的原因：血清批次差異或消化損傷
解決方案：接種后6小時內不移動培養瓶，可添加10μg/ml纖連蛋白
5）自發分化
表現：出現梭形細胞
解決方案：嚴格篩選匯合度（傳代前需達90%但不超過24小時）
6）細胞突然收縮脫落
檢查CO₂濃度（5%最佳）和培養基pH（7.2-7.4）
7）凍存與復蘇缺陷
1. 復蘇碎片過多
離心速度限定1000rpm（約150×g）5分鐘，高速離心加劇碎片產生。
凍存細胞密度建議為1×10⁶~5×10⁶/mL。
2. 存活率低
干冰運輸后需立即37℃快速復蘇，延遲操作導致冰晶二次損傷。
凍存液避免含血清，改用專用無血清配方。
8）污染與培養基問題
1. 隱污染風險
傳代時添加1%雙抗（青霉素-鏈霉素），但連續使用不超過3代，避免掩蓋污染。
2. 培養基失效
基礎配方：DMEM＋10% FBS＋1%雙抗，血清批次需預測試（不同批次生長差異可達30%）。
換液頻率：48-72小時/次，避免代謝廢物堆積。
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